肠出血性大肠杆菌志贺毒素Ⅰ型A亚单位(Stx1A)的表达及其单克隆抗体的制备

摘要

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)感染是一种重要的人畜共患病，在世界各地包括发达及发展中国家都有流行，其感染具有暴发性、强烈的致病性与致死性等特点，已成为全球性的公共卫生问题，对人类健康构成巨大威胁。EHEC感染可使人患腹泻(Diarrhea)、出血性结肠炎(Hemorrhagic Colitis，HC)，还可引发溶血性尿毒综合征(Hemolytic Uremic Syndrome，HUS)、血栓性血小板减少性紫癜（Thromboric Thromobocytopenic Porpura，TTP）等严重并发症，特别是HUS可对患者肾脏造成不可恢复性的功能损伤，病死率较高。
　　EHEC所分泌的志贺毒素（Shiga toxin，Stx）是介导细菌致病的重要因子，Stx可以穿越破损的肠上皮细胞进入血液循环，与其受体-丙糖酰基鞘氨醇(globotriaosylceramide，Gb3)或丁糖酰基鞘氨醇(globotetraosylceramide，Gb4)结合，造成肠道、中枢神经系统等器官的损伤，特别是Gb3受体含量较高的肾脏，受损后易引发HUS，危及生命。因此，Stx已经成为诊断、治疗EHEC感染及其并发症的靶向分子，本研究旨在制备StxⅠ型A亚单位(Stx1A)的单克隆抗体。
　　根据GenBank公布的Stx1A基因序列设计引物，以EHEC O157∶H7分离株基因组DNA为模板，PCR扩增出具有完整开放阅读框架(Open Reading Frames，ORF)Stx1A基因，序列分析表明扩增的Stx1A基因核苷酸序列与GenBank公布序列一致。将Stx1A基因经过限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到pET-22b(+)中，构建原核表达载体pET-22b(+)-Stx1A，转化大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG低温诱导表达重组蛋白Stx1A，重组蛋白Stx1A经细胞破碎仪破碎后，用NiSO4亲和层析柱纯化、PBS透析获得纯化的重组蛋白Stx1A。SDS-PAGE与蛋白质免疫印迹法(Western blotting)结果表明重组蛋白与其预期大小相符，质谱分析结果表明该重组蛋白即为StxⅠ型A亚单位。
　　重组Stx1A蛋白与弗氏佐剂充分乳化，免疫BALB/c小鼠，经酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测、多次有限稀释亚克隆、筛选得到能稳定分泌抗Stx1A单克隆抗体的杂交瘤细胞株6株，分别命名为5D3-H6、10G9-D9、4E2-H4、6E10-D11、8E7-E6、2F6-F8。结果表明其中两株单抗，8E7-E6和2F6-F8能与天然Stx1毒素实现有效的杂交。该两株杂交瘤细胞在体外连续传代3个月和冻存后再复苏均不影响抗体分泌的稳定性。总之，Stx1A特异性单抗的制备为肠出血性大肠杆菌的快速、特异性诊断奠定了基础。

目录

声明

论文说明

摘要

前言

第一章 文献综述

1 EHEC研究进展

1．1 EHEC概述

1．2 EHEC病原学

1．3 EHEC传播途径

1．4 EHEC流行特征

1．5 EHEC临床症状

2 EHEC致病机理

2．1 EHEC粘附因子

2．2 志贺毒素(Stx)

参考文献

第二章 肠出血性大肠杆菌O157：H7志贺毒素I型A亚单位的表达

1 材料

1．1 菌种与载体

1．2 实验动物

1．3 主要试剂

1．4 主要试剂的配制

1．5 主要仪器设备

2 方法

2．1 Stx1A基因的克隆

2．2 Stx1A重组蛋白的表达和纯化

2．3 重组蛋白的质谱鉴定

2．4 Stx1A免疫血清的制备

2．5 免疫转印

3 结果

3．1 Stx1毒素A亚单位基因的克隆

3．2 菌落PCR鉴定

3．3 重组质粒pET22b(+)-Stx1A核苷酸序列分析

3．4 重组工程菌的诱导表达和纯化

3．5 质谱鉴定结果

3．6 免疫转印

4 讨论

参考文献

第三章 肠出血性大肠杆菌志贺毒素I型A亚单位(Stx1A)单克隆抗体的制备和鉴定

1 材料和设备

1．1 实验动物

1．2 材料

1．3 主要仪器设备

2 方法

2．1 动物免疫

2．2 间接ELISA检测方法的建立

2．3 ELISA检测三次免疫后小鼠血清效价

2．4 杂交瘤细胞系的建立及鉴定

2．5 免疫共沉淀实验

2．6 单克隆抗体稳定性检测结果

2．7 单克隆抗体的纯化、保存

3 结果

3．1 间接ELISA方法的建立

3．2 免疫小鼠ELISA分析结果

3．3 杂交瘤细胞株的筛选和亚克隆

3．4 菌株志贺毒素检测

3．5 免疫共沉淀结果

3．6 单克隆抗体稳定性检测结果

3．8 单克隆抗体的纯化

4 讨论

参考文献

全文总结

致谢

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