成熟志贺毒素A亚单位(ShT-A)全长与截短片段在E.coli中的表达及多抗制备

摘要

根据G enB ank中Ⅰ型痢疾志贺菌ShT-A基因的核苷酸序列,设计合成了2对引物,分别进行PCR扩增,将PCR产物分别与pGEM-T连接构建了克隆质粒pGEM-TA1和pGEM-TA2。用B amHⅠ和K pnⅠ以及B amHⅠ和X hoⅠ双酶切pGEM-TA1和pGEM-TA2,均得到大小为895 bp的ShT-A基因片段,分别与pQE 30和pET 21a(+)原核重组表达载体连接,构建pQE 30-A2和pET-21A1原核重组表达质粒。工程菌M 15/pQE 30-A 2和BL-21/pET-21A 1经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,均没有目的蛋白表达。这表明全长ShT-A可能对E.coli细胞产生毒性作用。DNA s is软件分析ShT-A基因序列,发现在513 bp处有H indⅢ位点,以ShT-A上游引物的B amHⅠ和H indⅢ从pGEM-TA1切出1个513 bp的截短片段,重新插入表达载体pQE 30,经PCR和双酶切鉴定正确后,得到pQE 30-A513重组表达质粒,转化E.coliM 15经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,在20 000处出现1条特异性的表达蛋白带,与截短ShT-A513相对分子质量相符。经薄层扫描分析,该截短片段的表达量约占菌体总蛋白的37.4%,主要为包涵体形式。免疫印迹结果表明,表达的重组ShT-A513蛋白同抗ShT-A513鼠多抗有特异性结合。