鸡TRPV6 RNA干扰质粒的构建及其对成骨细胞钙转运基因表达的影响

摘要

目的：Ca2+在细胞信号转导中起着重要的作用，TRPV6是高度的Ca2+选择性通道，是Ca2+向细胞内转运的限速步骤。但是，TRPV6在鸡体内的调节机制尚不清楚，本文旨在研究沉默TRPV6对钙转运基因的影响，进而阐明TRPV6在鸡体内的调节机制。
　　方法：根据已知Genebank TRPV6 mRNA序列和siRNA的设计原则，利用美国Ambion公司的在线设计软件，进行全基因扫描和分析。筛选3个可能的RNA干扰靶位点，设计3个siRNA序列（与鸡的其他基因无同源性）和一个阴性对照序列（该序列与任何鸡类基因均无同源性）。按照选定的干扰靶位点设计相应的shRNA DNA表达模板，将shRNA与pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体连接，通过转化、筛选、鉴定，选择阳性克隆。为探明设计的3个TRPV6 RNA干扰质粒对成骨细胞TRPV6基因表达的抑制效果，提取高纯度无内毒素TRPV6 RNA干扰质粒，并将其转染到鸡成骨细胞，同时采用Real-time PCR和Western-blot的方法检测TRPV6定量表达变化，筛选出能有效抑制TRPV6表达的质粒。并将该质粒转染到鸡成骨细胞，同样地采用Real-time PCR和Western-blot的方法检测钙转运基因、OPG和RANKL的定量表达变化。
　　结果：酶切和测序结果显示，成功构建了鸡TRPV6 RNA干扰质粒。在探明TRPV6 RNA干扰质粒对成骨细胞TRPV6基因表达的抑制效果的试验中，Real-timePCR结果表明，与对照组比较，在转染48h后质粒pSIREN-TRPV6-3可使TRPV6的表达水平降低45.7％(P＜0.01)，质粒pSIREN-TRPV6-2可使TRPV6的表达水平降低27.8％(P＜0.05)，而pSIREN-TRPV6-1并未明显改变TRPV6的表达(P＞0.05);Western-blot结果显示，pSIREN-TRPV6-3可明显抑制TRPV6的表达水平(P＜0.01)。将重组质粒pSIREN-TRPV6-3转染到鸡成骨细胞，Real-time PCR结果显示，calbindin-D28K的表达水平降低了27.9％(P＜0.01)，而PMCA1b、NCX1、OPG和RANKL的表达未发生改变。Western-blot结果表明:calbindin-D28K的表达显著降低(P＜0.01)，RANKL的表达未明显改变。
　　结论：成功构建了鸡TRPV6 RNA干扰质粒;在成骨细胞钙转运过程中，TRPV6只调节calbindin-D28K的表达，而对NCX1、PMCA1b、OPG和RANKL的表达没有影响。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语

前言

第一章 瞬时受体电位(TRP)钙离子通道在骨稳态中的作用

1 细胞外钙稳态的调节及对骨稳态的作用

2 骨细胞内的钙离子信号系统

2．1 破骨细胞内的钙信号系统

2．2 软骨细胞内的钙信号系统

2．3 成骨细胞内的钙信号系统

3 TRP通道在骨生物学中的作用

3．1 TRPV6

3．2 TRPV5

3．3 TRPV4

3．4 TRPV2

3．5 TRPV1

参考文献

第二章 鸡TRPV6基因RNA干扰质粒的构建

1 材料与方法

1．1 主要仪器

1．2 主要试剂

1．3 TRPV6特异性siRNA序列的设计

1．4 shRNA序列DNA模板的设计

1．5 shRNA与pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体的连接

1．6 转化并扩增重组质粒

1．7 抽提重组TRPV6 RNA干扰质粒

1．8 质粒的酶切与测序鉴定

2 结果

2．1 重组质粒的酶切鉴定

2．2 重组质粒的测序鉴定

3 讨论

4 小结

参考文献

第三章 TRPV6 RNA干扰质粒对成骨细胞TRPV6表达的沉默效果

1 材料与方法

1．1 主要仪器

1．2 主要试剂

1．3 成骨细胞培养

1．4 高纯度无内毒素质粒的提取

1．5 成骨细胞转染

1．6 Real-time PCR检测TRPV6基因mRNA表达

1．7 Western-blot检测成骨细胞中TRPV6蛋白表达

1．8 数据分析与统计

2 结果与分析

2．1 成骨细胞碱性磷酸酶染色鉴定

2．2 成骨细胞的转染效率

2．3 转染48 h后成骨细胞TRPV6的mRNA表达水平

2．4 转染48 h后成骨细胞TRPV6基因的蛋白表达水平

3 讨论

4 小结

参考文献

第四章 沉默TRPV6对成骨细胞钙转运基因表达的影响

1 材料与方法

1．1 主要仪器

1．2 主要试剂

1．3 成骨细胞的培养

1．4 高纯度无内毒素质粒的提取

1．5 成骨细胞转染

1．6 Real-time PCR分析

1．7 Western-blot分析

1．8 数据分析和统计

2 结果与分析

2．1 沉默TRPV6基因对calbindin-D28K、PMCA1b和NCX1 mRNA表达水平的影响

2．2 沉默TRPV6基因对calbindin-D28K蛋白表达水平的影晌

3 讨论

4 小结

参考文献

第五章 沉默TRPV6对成骨细胞OPG和RANKL基因表达的影响

1 材料与方法

1．1 主要仪器

1．2 主要试剂

1．3 成骨细胞的培养

1．4 高纯度无内毒素质粒的提取

1．5 成骨细胞的转染

1．6 Real-time PCR分析

1．7 Western-blot分析

1．8 数据分析和统计

2 结果与分析

2．1 沉默TRPV6基因对OPG和RANKL mRNA表达水平的影响

2．2 沉默TRPV6基因对RANKL蛋白表达水平的影响

3 讨论

4 小结

参考文献

全文结论

论文创新之处

攻读硕士学位期间发表论文

致谢