肌内磷脂酶在传统板鸭加工中对磷脂的降解作用研究

摘要

腌腊肉制品不但拥有悠久的历史，而且具有浓郁的腊香风味、柔韧的质感和良好的耐藏性。涉及腊香风味的生化反应错综复杂，其形成机理尚未完全阐明，但大量研究证实:肌内脂类物质（特别是磷脂）中不饱和脂肪酸的解离、氧化及氧化产物的进一步反应，是形成腊香风味的主要原因。因此，肌内磷脂的酶解与腌腊肉制品风味关系密切。本论文以板鸭为对象，首先从肌内磷脂所处的肌肉内环境入手，检测板鸭加工过程中主要理化指标，了解可能影响肌内磷脂酶解作用的外在因素;同时跟踪加工中磷脂酶A2和磷脂酶C的酶活力，结合肌内脂质脂肪酸构成变化，明确二者与肌内磷脂降解的相关性;进一步通过粗酶液与卵磷脂模拟反应体系的特征产物分析，确定二者中哪种酶的作用更大;最后，从鸭肉中分离纯化出该酶，并研究其酶学特性。具体研究内容和结果如下:
　　1.板鸭加工中肌内脂质、理化指标和超微结构变化
　　检测板鸭加工过程中肌内脂肪含量、中性酯占总脂比例、游离脂肪酸占总脂比例、磷脂占总脂比例、NaCl含量、TBA值、水分含量、pH值、蛋白质含量、游离氨基酸含量、L*、a*、b*以及超微结构的变化情况。结果表明:在板鸭加工中，pH值、中性酯占总脂比例、b*值变化不明显（P＞0.05），水分、肌内磷脂占总脂比例、L*值、a*值显著降低(P＜0.05)，而NaCl含量、脂肪含量、游离脂肪酸占总脂比例、蛋白质含量、游离氨基酸总含量、TBA值明显升高(P＜0.05);同时肌肉超微结构在风干阶段发生明显的收缩，并出现裂缝。相关性分析表明，磷脂占总脂比例和游离脂肪酸占总脂比例呈显著负相关（r=-0.998，P＜0.01），而中性脂占总脂比例和游离脂肪酸占总脂比例显著正相关(P＜0.01)，表明板鸭加工过程中磷脂发生水解产生了游离脂肪酸;磷脂占总脂比例与NaCl含量、蛋白质含量、脂肪含量、TBA值、水分含量、中性酯比例、游离脂肪酸比例、游离氨基酸总含量等指标极显著相关(P＜0.01)。综合上述结果，初步明确了在板鸭加工中，肌内磷脂处于高盐、弱酸的环境，并发生了降解现象，同时肌肉内部结构的破坏和收缩挤压，为磷脂与胞内酶类的接触增加了机会，也为加速磷脂降解产物-游离脂肪酸的氧化提供了可能。
　　2.板鸭加工中磷脂酶A2和磷脂酶C活力变化及其与肌内磷脂降解的相关性
　　跟踪板鸭加工过程中，腿肉中磷脂酶A2、磷脂酶C酶活力以及中性酯、游离脂肪酸、磷脂脂肪酸构成的变化。结果表明:磷脂酶A2的活性在板鸭加工过程中逐渐下降（P＜0.05），但到风干12天时仍能保留83.70％的酶活力;磷脂酶C的活性从原料到干腌时显著升高(P＜0.05)，然后从干腌到风干6天显著下降，在风干6天到12天时显著升高（P＜0.05），在加工末期磷脂酶C保留86.78％的酶活力;游离脂肪酸和中性脂中不饱和脂肪酸的比例逐渐升高(P＜0.05)，二者的增加量与磷脂中多不饱和脂肪酸的减少量显著相关（r=-0.841，P＜0.05，r=-0.946，P＜0.01），对单个脂肪酸而言，磷脂中亚油酸(C18∶2)和花生四烯酸(C20∶4)显著减少(P＜0.05)，然而在游离脂肪酸和中性酯中它们显著升高（P＜0.05）。上述结果，初步证实了板鸭加工中，磷脂酶A2和磷脂酶C参与了肌内磷脂的水解。
　　3.磷脂模拟体系中磷脂酶A2和磷脂酶C的酶解作用比较
　　以鸭肉中客观存在的一种卵磷脂(C18∶2/C16∶0 PC)为底物，与鸭肉粗酶液组成模拟体系，反应条件与板鸭加工条件（温度10℃以下）和产品特点（盐分含量8.92％、pH6.2左右）相对应，即反应条件为pH6.2、温度9℃、NaCl含量8.92％、时间为60h，通过HPLC-ELSD（高效液相色谱-蒸发光散射检测器）分析特征酶解产物。结果如下:建立了HPLC-ELSD卵磷脂模拟反应体系中酶解产物的分析方法;首先通过二氯甲烷-甲醇（2/1，体积比）充分萃取卵磷脂模拟反应体系中的酶解产物，再通过HPLC-ELSD对产物进行分析;HPLC的色谱柱为XBridge C18，250 mm×4.6 mm×5.0μm，柱温40℃;流动相A、B、C分别为二氯甲烷、乙腈、水，采用梯度洗脱;ELSD检测器:氮气雾化，增益50，雾化温度65℃，气流压力45 psi;在该色谱条件下卵磷脂(PC)、溶血卵磷脂(LPC)、脂肪酸(FA)、甘油单酯(MG)、甘油二酯(DG)、甘油三酯(TG)分离良好，回归方程的相关系数均超过0.99;通过HPLC-ELSD分析，模拟体系中卵磷脂的初始含量为1978.24μg，酶解反应后下降到1626.35μg，酶解产物中检测少量的磷脂酶A2特征性产物LPC和FA（分别为49.67μg和42.25μg），但并未发现磷脂酶C的酶解产物DG。以上结果证实磷脂酶A2在磷脂酶解中作用更大。
　　4.磷脂酶A2的分离纯化及其酶学性质
　　从鸭腿肉中提取纯化磷脂酶A2后，研究其最适温度、最适pH、热稳定性、动力学方程、金属离子对酶活力的影响等酶学特性。结果表明:利用缓冲液（50 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，3 mM MgCl2，50 mM KCl，10 mM2-mercaptoethanol，pH7.5）从鸭腿肉中提取磷脂酶A2粗酶液，随后依次采用70％硫酸铵沉淀、DEAE-Cellulose(DE-52)阴离子交换层析100％线性洗脱、Superdex200凝胶过滤层析、Source15Q阴离子交换层析45 min达到100％缓冲液(50 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，3 mM MgCl2，50 mM KCl，10 mM2-mercaptoethanol，1 MNaCl，pH7.5)线性洗脱，最终获得了基本达到电泳纯的磷脂酶A2，经SDS-PAGE测定发现其分子量约为50 kDa，纯化后磷脂酶A2的比活力达到282.1 U/mg，纯度提高了201.5倍，回收率为1.5％;该酶的最适反应温度为32℃，最适反应pH值为6.0，32℃以下有较好的稳定性，而在60℃时极易失活，该酶作用底物为L-α-1-棕榈酰屯基-2-[14C]花生四烯酸-sn-甘油磷脂酰胆碱时的Km为0.03 mmol/L，最大反应速度Vmax为1000 U/mg; Cu2+、 Ca2+对鸭肉磷脂酶A2有激活作用，其中Cu2+的激活作用更为明显，在浓度为10mM时，鸭肉磷脂酶A2的相对酶活力增加了51.33％，而Mn2+和Zn2+对磷脂酶A2的酶活力影响不大。上述结果表明，鸭肉中存在的这种磷脂酶A2，在板鸭加工条件（低温、高盐）下其酶活力相对稳定，且肌肉内环境的pH值接近该酶的最适pH值。
　　综上所述:板鸭加工过程中，伴随着肌肉理化指标和超微结构的改变，肌内磷脂在磷脂酶A2、磷脂酶C等作用下发生了水解;通过分析卵磷脂模拟反应体系特征酶解产物和磷脂酶A2的酶学特性，共同证实了磷脂酶A2在肌内磷脂水解中的作用更重要。

目录

声明

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表格索引

摘要

缩写符号

前言

第一章 文献综述

1 传统板鸭的加工状况

1．1 传统板鸭的分类

1．2 传统板鸭的加工工艺

2 腌腊肉制品加工过程中的主要生化变化

2．1 腌腊肉制品加工过程中主要理化指标的变化

2．2 腌腊肉制品加工过程中风味成分的变化

3 磷脂在腌腊肉制品加工过程中的变化

3．1 磷脂的分类

3．2 不同磷脂种类在加工中变化的分析

3．3 腌腊肉制品中磷脂水解相关酶系

3．4 磷脂水解酶活力检测方法

3．5 磷脂水解对腌腊肉制品品质的影响

4 磷脂模拟体系

4．1 缓冲水溶液

4．2 有机溶剂

4．3 微乳体系

4．4 囊泡体系

5 磷脂水解酶的分离纯化

5．1 蛋白纯化

5．2 脂肪酶的分离纯化

5．3 磷脂酶A1的分离纯化

5．4 磷脂酶A2的分离纯化

5．5 磷脂酶C的分离纯化

5．6 磷脂酶D的分离纯化

6 存在问题及本研究的内容和意义

参考文献

第二章 板鸭加工中肌内脂质、理化指标和超微结构变化

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 肌内脂质的变化

2．2 板鸭加工环境温湿度的变化

2．3 理化指标的变化

2．4 超微结构的变化

2．5 相关性分析

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第三章 板鸭加工中磷脂酶A2和磷脂酶C活力变化及其与肌内磷脂降解的相关性

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 板鸭加工中磷脂酶A2和磷脂酶C活力变化

2．2 板鸭加工过程中性酯、游离脂肪酸和磷脂的脂肪酸构成的变化

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第四章 磷脂模拟体系中磷脂酶A2和磷脂酶C的酶解作用比较

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 色谱条件的选择

2．2 萃取剂的选择

2．3 酶解反应产物的HPLC分析结果

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第五章 磷脂酶A2的分离纯化及其酶学性质研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 鸭肉磷脂酶A2的分离纯化

2．2 鸭肉磷脂酶A2的酶学性质研究

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文结论

论文创新点

工作展望

致谢

攻读博士学位期间发表论文情况