公开/公告号CN1245532A
专利类型发明专利
公开/公告日2000-02-23
原文格式PDF
申请/专利权人 诺沃挪第克公司;
申请/专利号CN97181706.5
申请日1997-12-09
分类号C12N9/20;C11B3/00;
代理机构柳沈知识产权律师事务所;
代理人巫肖南
地址 丹麦鲍斯韦
入库时间 2023-12-17 13:33:50
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-01-23
专利权有效期届满 IPC(主分类):C12N9/20 授权公告日:20040505 申请日:19971209
专利权的终止
2004-05-05
授权
授权
2001-05-02
著录项目变更 变更前: 变更后: 申请日:19971209
著录项目变更
2000-03-01
实质审查请求的生效
实质审查请求的生效
2000-02-23
公开
公开
发明领域
本发明涉及利用磷脂酶在含有大量非水合磷的食用油中降低含有磷成分的含量的方法。
另外，本发明涉及具有磷脂酶活性的酶，编码具有磷脂酶活性的酶的克隆DNA序列，生产酶的方法，以及所述的酶在许多工业应用中的用途。
发明的背景
含有相对高量非水合磷含量的食用油的酶促脱胶：
已知利用磷脂酶对水脱胶的食用油进行酶促脱胶(美国5,264,367，Metallgesellschaft，Rohm)，可以降低所述的水脱胶食用油的磷含量。
但是，这一过程仍然可以改进，尤其是进行含有高量非水合磷(NHP)和/或相对高量的粘液的食用油的酶促脱胶。
因此，本发明的目的是提供降低这样油的含磷成分的含量的方法，其中所述的方法包括利用磷脂酶。
本发明的磷脂酶
磷脂如卵磷脂或磷脂酰胆碱，由将在外部(sn-1)和中间(sn-2)位置的两个脂肪酸酯化和将在第三个位置的磷酸酯化的甘油组成；依次磷酸可以酯化成氨基乙醇。磷脂酶是参与磷脂的水解的酶。可以区别几个类型的磷脂酶的活性，包括磷脂酶A1(PLA1)和A2(PLA2)，它们水解一个脂酰基团(分别在sn-1和sn-2位置)，以形成溶血磷脂；和溶血磷脂酶(或磷脂酶B(PLB))，可以水解残留在溶血磷脂中的脂酰基团。个脂酰基团的能力(即，显示了PLA和/或PLB活性)。
以前鉴定的真菌PLA和/或PLB酶：
许多参考文献叙述了真菌磷脂酶的鉴定。为了更容易了解过去的领域现有技术状态的总的看法，已经将参考文献划分为两个部分。
第一部分涉及叙述目前确信不与本发明的真菌磷脂酶相关的真菌磷脂酶的鉴定的参考文献。包括这些参考文献主要为了概述在真菌磷脂酶的鉴定领域内现有技术的状态。
第二部分涉及叙述确信与本发明的真菌磷脂酶有关的真菌磷脂酶的鉴定的参考文献。
部分I
已经在各种真菌来源中发现具有磷脂酶A和/或B活性的酶，包括点青霉(也已知为产黄青霉；N.Kawasaki，生物化学杂志，77，1233-44，1975；N.Masuda等人，欧洲生物化学杂志，202，783-787，1991)，圆弧青霉(生物化学进程，30(5)：393-401(1995))，啤酒酵母(M.Ichimasa等人，农业生物化学，49(4)，1083-89，1985；F.paultauf等人，生物化学杂志269，19725-30，1994)，戴尔凯氏有孢圆酵母(罗茜糖酵母的旧名称；Y.Kuwabara，农业生物化学，52(10)，2451-58，1988；FEMS，微生物通讯，124，29-34)，粟酒裂殖酵母(H.Oishi等人，生物科学，生物技术，生物化学，60(7)，1087-92，1996)，黑曲霉(技术手册，G-zymeTMG999，酶生物系统有限公司；生物化学进程30(5)：393-401(1995)和离心伏革菌(S.Uehara等人，农业生物化学，43(3)，517-525，1979)。
部分II：
EP575133 A2叙述了从曲霉获得的真菌磷脂酶A1的分离和鉴定和将其用于工业应用。
在该应用中没有公开序列信息(既没有DNA也没有氨基酸)，也没有公开克隆该应用中讨论或表明的曲霉磷脂酶的方案或建议。
Tsung-Che等人(植物病理学纪要，58：1437-38(1968))简要地叙述了来自茄病镰孢的磷脂酶的鉴定。
EP 130 064叙述了显示从菌株尖孢镰孢DSM2672获得的脂酶活性的发酵肉汤的分离部分。另外，公开了在洗涤组合物中其应用。但是，EP130,064没有描述显示任何磷脂酶活性的这一部分。
WO96/13579叙述了从菌株大刀镰孢CBS513，94获得的脂酶，包括它的N末端序列。
但是，WO96/13579没有叙述任何显示磷脂酶活性的酶。
来自异孢镰孢的编码脂酶的cDNA序列被叙述了(来自异孢镰孢的编码脂酶的cDNA克隆和核苷酸序列，生物化学杂志，116，536-540，1994)。目前确信这一序列与本发明的克隆DNA序列相比是最相关的DNA序列(参见部分“与现有技术的比较”(见下文)。但是，这一参考文献没有叙述显示磷脂酶活性的任何酶。
来自点青霉的编码磷脂酶B的cDNA序列被叙述了(欧洲生物化学杂志202：783-787，1991)。但是，这一克隆DNA序列与本发明的DNA序列的同源性非常有限(参见部分“与现有技术的比较”(见下文))。
磷脂酶的工业应用：
许多磷脂酶的应用是本领域已知的，如在例如水脱胶油的酶促脱胶中利用磷脂酶(美国专利，5,264,367，Metallgesellschaft，Rohm)；淀粉水解产物的处理(特别是来自小麦淀粉)以便提高滤过率(EP219,269,CPC International)；作为面包生面团中的添加剂以便提高面包的弹性(US4567046，Kyowa Hakko)；和用于制备具有特别的乳化特性的溶血卵磷脂。
目前磷脂酶Lecitase(Novo Nordisk A/S)具有市场用途如用于油的脱胶。Lecitase是从猪胰中获得的哺乳动物酶。
已知特别是从丝状真菌，以工业经济可接受的产量重组生产真菌酶是可能的。
结果是，本发明的目的是提供改良的磷脂酶，例如用于如上所述的过程。
另外，本发明的目的是阐述以工业可接受的产量重组生产从丝状真菌获得的磷脂酶的过程和方法。
本发明的概要
通过用水提取进行了食用油的水脱胶。在这一处理中，一部分磷脂留在油中。利用一般性术语“非水合磷脂”(NHP)描述该部分。在油的生产中，除去NHP含量是必要的(美国专利5264367)。
本发明提供了除去含有相当高量NHP的油中的NHP含量的方法。
因此，在本发明的第一方面涉及了降低通过下面步骤测量后至少具有50ppm的非水合磷含量的食用油中的含磷成分的含量的方法，
i)在60℃，加入在水中含有柠檬酸单水合物的溶液预处理食用油30分钟(加入的水对油等于4.8％w/w；[柠檬酸]在水相中＝106毫摩尔/升，在水/油乳化液中＝4.6毫摩尔/升)；
ii)转移油乳液中的10毫升预处理水到试管中；
iii)在沸水浴中加热乳液30分钟；
iv)以5000rpm离心10分钟，
v)转移8毫升上层(油)相到新的试管，将它静置24小时；并且
vi)然后从上层的澄清相中取2克测量食用油中的非水合磷含量(ppm)；
并且其中所述的方法包括，将在pH1.5-8的所述的油与磷脂酶A1，磷脂酶A2，或磷脂酶B的水溶液接触，该溶液是在油中乳化直到油中的磷含量降低到小于11ppm，然后从处理的油中分离水相。
在本发明的另一方面涉及新克隆的磷脂酶。
在尖孢镰孢DSM2672中发现(和在EP130,064中叙述的)脂酶活性的特性的进一步研究表明分离的部分含有具有脂酶活性的几个成分，其中一个显示了磷脂酶活性。
尽管具有许多技术困难(见下文)，本发明人已经能够克隆显示来自镰孢属的菌株，更具体地尖孢镰孢菌株的磷脂酶A活性的酶。
已经第一次克隆了丝状真菌磷脂酶A并且因此本发明提供了编码丝状真菌磷脂酶A酶的克隆的DNA序列。
因此，本发明的一个方面涉及编码具有磷脂酶A活性的多肽的克隆的DNA序列，其中从丝状真菌中获得DNA序列。
在欧洲生物化学杂志202：783-787，1991中叙述了来自点青霉的编码磷脂酶B的cDNA序列。
但是，这一DNA序列仅仅显示了与本发明的DNA序列(SEQ ID NO123-1060)只有39％的非常有限的DNA同一性，另外，在所述的来自点青霉的PLB(66千道尔顿)和本发明的磷脂酶(29±10千道尔顿，见下文)之间生理特征如分子量的变化相当大。
另外，在现有技术的核苷酸和氨基酸序列之间的比较已经显示了本发明的DNA序列和/或对应的编码氨基酸序列与任何现有技术的DNA和/或氨基酸序列之间只有很小的同源性(见下文)。
因此，目前确信本申请中提供的DNA序列信息将有高价值，目的是例如克隆另一个相关的/同源磷脂酶编码DNA序列，因为特异的杂交探针和/或PCR引物现在可以容易地在本发明的所述DNA序列基础上构建。
另外，目前确信，在本申请提供的序列信息的基础上克隆编码相关的/同源的磷脂酶A和/或磷脂酶B的DNA序列都是可能的。
因此，在本发明的其它方面涉及编码显示磷脂酶A和/或磷脂酶B活性的酶的克隆DNA序列，其中DNA序列选自包括下面的组：
(a)克隆到存在于大肠杆菌DSM11299中的质粒pYES2.0的DNA序列的磷脂酶A编码部分；
(b)在SEQ ID NO：1中的位置23-1063，更优选地，SEQ IDNO：1中的位置113-1063，或甚至更优选地SEQ ID NO：1中位置113-929中显示的DNA序列或它的互补链；
(c)与(a)或(b)中确定的所述DNA序列至少有70％的同源性的DNA序列；
(d)在(a)或(b)中确定的DNA序列，编码显示磷脂酶活性的多肽且至少与SEQ ID NO：2的位置31-346显示的多肽序列有70％同源性，或更优选地与SEQ ID NO：2的位置31-303显示的多肽序列至少70％同源性；
(e)与含有SEQ ID NO：1中的位置23-1063显示的DNA序列的双链DNA探针在低严格性时杂交的DNA序列；
(f)编码具有SEQ ID NO：2的残基位置1到346，31到303，或31到303的同样的氨基酸序列，或(e)的任何DNA序列编码的氨基酸序列的的多肽DNA序列；和
(g)(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中所述的DNA序列的片段的DNA序列。
另外，本发明的磷脂酶已经被充分鉴定，并且已经发现在低pH时具有磷脂酶活性，这一特性使它非常适用于油脱胶。磷脂酶没有与膜结合，使它适用于商业生产和纯化。
因此，在本发明的另一方面涉及了具有磷脂酶A活性的分离的多肽，该多肽是从镰孢属的菌株获得的，并且具有
i)在pH范围3-10具有PLA活性，是在40℃测量的。
ii)如SDS-PAGE确定的，分子量为29±10千道尔顿；
iii)等电点(pI)范围在4.5-8；
iv)磷脂酶活性的最适温度范围在25-55℃，是利用卵磷脂作为底物在pH5测量的；
v)磷脂酶活性的最适pH范围为6-12，是利用卵磷脂作为底物在37℃测量的。
本发明的分离的磷脂酶的推断的氨基酸序列表示在SEQ ID NO：2。
已经确定了成熟分泌的分离的磷脂酶的N-末端氨基酸序列。所述的N末端序列显示了本发明的磷脂酶的成熟部分具有SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列，在SEQ ID NO：2的氨基酸31为起始。参见本文的工作实施例以便进一步详细了解(见下文)。
另外，已经确定了本发明的活性分泌的磷脂酶的C末端序列，具有SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列。在丝状真菌菌株米曲霉中，所述的C末端确定的磷脂酶获得重组表达。参见本文工作实施例以便进一步参考。
这些结果显示在从米曲霉表达的过程中，酶是C末端加工的，结果表明在SEQ ID NO：2中的Ser303是表达的成熟活性酶中最有可能的C末端的残基。但是，可以预见，即使发生进一步的C末端加工(即，给出所述序列的片段)，仍然具有表达的成熟活性酶。
因此，在本发明的另一方面涉及了显示磷脂酶A和/或B活性并且选自包括下面的组的分离的酶：
(a)克隆到大肠杆菌DSM11299中存在的质粒pYES2.0的DNA序列的磷脂酶A和/或B酶编码部分编码的多肽；
(b)具有SEQ ID NO：2的位置31-346显示的氨基酸序列的多肽；
(c)具有SEQ ID NO：2的位置31-303显示的氨基酸序列的多肽；
(d)(a)，(b)或(c)确定的多肽的类似物，该类似物与所述的多肽至少具有70％的同源性；和
(e)(a)，(b)，(c)或(d)的片段。
在本发明的更进一步的方面提供了重组表达载体，该载体能够异源重组生产本发明的酶。因此它可能生产高度纯化的磷脂酶组合物，特征是无同源杂质。这在许多工业应用中是很大的优点。
本发明实验性(见下文)地证明了从大刀镰孢和尖孢镰孢两个菌株获得的磷脂酶在工业的相关应用中具有改良的特性。可以预见从镰孢属的菌株获得的磷脂酶将具有与工业应用有关的改良特性。
因此，甚至在的另一方面，本发明涉及磷脂酶在包括用该磷脂酶处理磷脂或溶血磷脂的过程中应用以水解脂酰基团，所述磷脂酶是从镰孢属，如大刀镰孢，异孢镰孢，茄病镰孢的菌株，或特别是尖孢镰孢的菌株获得的。
最后，本发明涉及分离的，基本纯化的大肠杆菌菌株DSM11299的生物学培养物，该菌株含有从丝状真菌尖孢镰孢的菌株获得的磷脂酶编码DNA序列(克隆到存在于大肠杆菌DSM11299中的质粒pYES2.0中的DNA序列的磷脂酶编码部分)，或者具有保留的磷脂酶编码能力的所述大肠杆菌菌株的任何突变体的分离的基本上纯的生物学培养物。
与现有技术的序列同源性比较
在核苷酸和蛋白质数据库，利用本发明的磷脂酶进行了同源性检索。同源性检索显示关系最近的已知序列是来自异孢镰孢的脂酶(图1中说明了氨基酸排列)。
编码磷脂酶的本发明的DNA序列(SEQ ID NO：123-1060)显示与来自异孢镰孢的已知脂酶序列(基因库数据库参考号S77816)只有62％的DNA同源性，并且本发明的磷脂酶的对应的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)显示与根据上面的已知DNA序列推断的氨基酸序列的同源性只有60％(参见图1)。
这显示了本发明的磷脂酶的DNA和/或氨基酸序列确实与任何已知DNA和/或氨基酸序列不同。
叙述了编码来自点青霉的磷脂酶B的cDNA序列(欧洲生物化学杂志，202：783-787，1991)。但是，这一DNA序列(基因库数据库参考号X60348)显示与本发明的DNA序列(SEQ ID NO：23-1060)只有39％的非常有限的DNA同一性，本发明的磷脂酶的对应的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)显示与根据上面已知的PLB DNA序列推断的氨基酸序列只有20％的同一性。
如本说明书后面叙述进行了同源性的计算。
附图：
图1：SEQ ID NO：2中显示的氨基酸序列与现有技术的来自异孢镰孢的脂酶序列的比较。
图2：LecitaseTM和来自本发明的尖孢镰孢的磷脂酶的酶促脱胶能力的比较。
定义
在进一步详细讨论本发明之前，定义了下面的术语。
“克隆的DNA序列”：该术语“克隆的DNA序列”指根据基因工程中利用的标准克隆方法进行克隆的以将天然位置的DNA区段再定位到它将被再生的不同位点的DNA序列。克隆过程包括切出和分离需要的DNA区段，在载体分子中插入DNA的片段，和将重组的载体掺入将复制DNA区段的多个拷贝或克隆的细胞中。
可取代地将本发明的“克隆的DNA序列”命名为“DNA构建体”或“具有DNA序列的克隆的多聚核苷酸”，“分离的DNA序列”。
“从中获得”：对于本发明的目的，术语“从中获得”，如本文所用，是有关特异的微生物来源的，指通过特异的来源或通过来源的基因已经插入的细胞生产该酶和随后生产编码所述的酶的DNA序列。
“分离的多肽”：如本文定义，该术语“分离的多肽”或“分离的磷脂酶”如本发明的磷脂酶所用，是基本无其它非磷脂酶多肽例如SDS-PAGE确定至少20％纯度，优选地至少40％纯度，更优选地60％纯度，甚至更优选地80％纯度，最优选地90％纯度，甚至最优选地95％纯度的磷脂酶或磷脂酶部分。
当分离的多肽至少是60％纯度，可以使用术语“高度分离的多肽”。
可以替代地将“分离的多肽”命名为“纯化的多肽”。
“同源杂质”：如本文所用，术语“同源杂质”指来源于原始地获得本发明的酶的同源细胞的任何杂质(例如，另一个多肽而不是本发明的酶)。在本发明中，同源细胞可以例如是尖孢镰孢的菌株。
“磷脂酶编码部分”：如本文所用，术语“磷脂酶编码部分”与DNA序列相关使用时指对应于翻译成多肽序列的区域的DNA序列的区域。
在SEQ ID NO：1显示的DNA序列中，它是在第一个“ATG”起始密码(mRNA中的“AUG”密码)和接着的终止密码(“TAA”，“TAG”或“TGA”)之间的区域。
另外，翻译的多肽，除了显示磷脂酶活性的成熟序列，可以进一步含有N末端信号和/或前肽序列。信号序列通常指导多肽的分泌，前肽通常指导多肽的折叠。进一步信息参见Egnell，P.等人，分子微生物学，6(9)：1115-19(1992)或Stryer，L.，“生物化学”W.H.，Freeman和Company/纽约，ISBN 0-7167-1920-7。
“DNA和/或氨基酸序列的修饰”：该术语“修饰”与本文讨论的DNA和/或氨基酸序列的修饰的相关使用时定义为包括化学修饰以及遗传操作。修饰可以是需要的氨基酸中的替代，缺失和/或插入。
“磷脂酶A”：用于本文的与本发明的酶相关使用时术语“磷脂酶A”打算覆盖具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性的酶。
根据标准的酶EC-分类定义磷脂酶A1为EC3.1.1.32。
官方名称：磷脂酶A1(PLA1)。
催化的反应：
磷脂酰胆碱+H(2)O<>
2-酰基甘油磷酸胆碱+脂肪酸阴离子
评论：
比EC 3.1.1.4具有广谱的多的特异性
根据标准酶EC分类法定义磷脂酶A2为EC3.1.1.4
官方名称：磷脂酶A2(PLA2)。
可替代的名称：磷脂酰胆碱2-酰基水解酶；卵磷脂a；磷脂酶；或磷脂酰脂酶。
催化的反应：
磷脂酰胆碱+h(2)o<>
1-酰基甘油磷酸胆碱+脂肪酸阴离子
评论：也作用于磷脂酰乙醇胺，缩醛磷脂胆碱和磷脂，除去附着于2-位置的脂肪酸。
“磷脂酶B”：根据标准酶EC分类定义磷脂酶B为EC3.1.1.5。
官方名称：溶血磷脂酶
可替代的名称：卵磷脂酶b；溶血卵磷脂酶；
磷脂酶b；或plb。
催化的反应：
2-溶血磷脂酰胆碱+h(2)o<>
甘油磷酸胆碱+脂肪酸阴离子
“磷脂酶活性”：如本文所用，在与本发明的酶相关使用时，术语“磷脂酶活性”或“具有/显示磷脂酶活性”打算特异地指具有至少下面实验性定义的磷脂酶活性(PLA或PLB)的量的酶。
因此，本文定义显示磷脂酶活性的酶为在本文实施例6中(见下文)显示的“单层磷脂酶测试”中具有的磷脂酶活性至少0.25纳摩尔/分钟，酶剂量：60微克，25℃；更优选地至少0.40纳摩尔/分钟，酶剂量：60微克，25℃；更优选地至少0.75纳摩尔/分钟，酶剂量：60微克，25℃；更优选地至少1.0纳摩尔/分钟，酶剂量：60微克，25℃；更优选地至少1.25纳摩尔/分钟，酶剂量60微克，25℃；甚至更优选地至少1.5纳摩尔/分钟，酶剂量：60微克，25℃的酶。
目前确信只有具有这样的明显的磷脂酶活性的酶是有工业重要性的，例如用于脱胶(美国专利5,264,367)。
“具有磷脂酶副活性的脂酶”：因此，该术语“具有磷脂酶副活性的脂酶”定义为具有磷脂酶副活性的脂酶，其中在实施例6中显示的“单层磷脂酶测试”中的磷脂酶副活性小于上面提到的数据。
许多脂酶具有这样的磷脂酶副活性。在本文的工作实施例6(见下文)中，显示了一些具有磷脂酶副活性的脂酶。
“粗制油”：粗制油(也称为非脱胶油)可以是来自例如，油菜籽，大豆，或葵花子的压缩或提取油或其混合物。在粗制油中的磷脂含量可以对应于磷含量的范围200-1200ppm，更优选地，范围为250-1200ppm的从0.5-3％w/w内变化。除了磷脂，粗制油也含有小浓度的碳水化合物，糖化合物和Ca，Mg和Fe的金属/磷脂酸复合物。
“半粗制油”：任何不是粗制油，但具有磷脂含量250ppm以上，更优选地500ppm以上的油。这样的油可以例如，通过进行同样于下面所述的“水脱胶油”加工过程加工粗制油获得。
“水脱胶油”：通常通过将1-3％w/w的热水与温(60-90℃)粗制油混合获得水脱胶油。通常处理时期是30-60分钟。水脱胶步骤除去了磷脂和粘液胶，这些物质当水合时在油中变成不溶。通过沉淀，过滤，或离心，离心是较普遍的操作，可以从油中分离水合磷脂和胶。
所述的水脱胶过程中的基本目的是从油中分离水合磷脂。如上所述，在油中混合热水在本文应该广义地理解为根据本领域的标准水脱胶过程，将水溶液混合到油。
可替代地，本文命名为的“水脱胶油”的过程可以称为“湿精制除去粘质”(参见美国专利5,264,367)。
本发明的详细说明
含有高量非水合磷脂/磷脂的食用油的酶促脱胶方法
对于本发明，食用油中非水合磷的量测量如下：
i)在60℃，通过加入含有溶于水的柠檬酸单水合物的溶液，预处理食用油30分钟(加入的水对油等于4.8％w/w；[柠檬酸]在水相中＝106mM，在水/油乳液＝4.6mM)；
ii)转移10毫升预处理的油包水乳液到试管中；
iii)在沸水浴中加热乳液30分钟；
iv)在5000rpm离心10分钟，
v)转移约8毫升上层(油)相到新的试管，静置24小时；
vi)在静置后，从上层澄清相取出2克用于测量食用油中非水合磷的含量(ppm)。
在本文的工作实施例中有进一步详细的参考说明。
正如本文的工作实施例中说明的，不同食用油的磷脂组分(可水合对非水合磷脂)变化相当大。结果是，在不同的水脱胶油中的残留的磷脂的水平将在宽的范围内变化(例如，从约30ppm到200ppm)。
对于酶促脱胶，酶最适剂量是取决于在如上所述的水脱胶或柠檬酸/水预处理后存在的非水合磷脂的量。
另外，油中存在的非水合磷脂的量越高，酶促脱胶方法越有效。
本发明提供了除去含有相当高量NHP的油中NHP含量的方法。
优选地，食用油含有非水合磷含量至少60ppm，更优选地至少100ppm，甚至更优选地至少200ppm。
更优选地，食用油含有非水合磷的含量范围为60-500ppm，更优选地范围为100-500ppm，甚至更优选地200-500ppm。
根据本文的说明，定义为具有相当高量非水合磷的食用油可以是水脱胶油，或更优选地可以是粗制油或半粗制油。
因此，本发明的实施方案涉及根据本发明的第一方面的方法，其中所述的食用油是粗制油，特征是在进行本发明的方法之前，所述的粗制食用油是具有磷含量超过250份/百万(ppm)的油，在进行本发明的方法之前，该油还没有水脱胶(水脱胶包括将热水与温粗制油混合，接着除去磷脂，这些磷脂当水合时在油中变成不可溶)。
优选地，在进行本发明的所述方法之前，这样的粗制食油具有的磷含量约350ppm以上，更优选地，400ppm以上，甚至更优选地500ppm以上，和最优选地600ppm以上。
另外，在进行本发明的所述方法之前，所述的粗制食油优选地具有的磷含量范围为250-1500ppm，更优选地范围为350-1500ppm，甚至更优选地范围为500-1500ppm，和最优选地范围为500-1500ppm。
本发明的粗制食油的酶促脱胶方法比现有技术的水脱胶食用油的酶促脱胶的方法(US5,264,367)更具有优点的，因为根据本发明，处理粗制油的直接酶促脱胶方法将节省油的水脱胶的现有步骤。
这就节省了时间和金钱。通常通过混合热水和温(60-90℃)粗制油30-60分钟获得水脱胶油。相反，本发明的粗制油的酶促脱胶的整个过程可以在小于1小时，真正的酶促处理约25分钟中进行，参见本文的工作实施例以便进一步详细了解。
另外，根据本文的叙述，定义为具有相当高量非水合磷的食用油可以是半粗制油。
因此，本发明的实施方案涉及根据本发明的第一方面的方法，其中所述的食用油是半粗制油，特征是在进行本发明的方法之前，所述的半粗制油具有的磷含量在500份/百万(ppm)以上，并且其中的所述的油在进行本发明的方法之前已经进行水脱胶。
优选地，所述的半粗制油是在进行本发明的方法之前，具有磷含量600份/百万(ppm)以上，更优选地750份/百万(ppm)以上的油。
通常，食用油的水脱胶将降低油中的磷含量到低于500ppm的水平。
因此，根据本发明，进行降低食用油中含磷成分的水平的方法之前，如本文所述的半粗制油可以例如只是已经部分水脱胶的。
术语“部分水脱胶”是指与标准的水脱胶过程比较，油的水脱胶过程只是部分/短过程。
“部分水脱胶”过程可以通过只在油中混合0.5％的热水(标准是1-3％热水，参见本文的“定义”部分)，或通过降低处理时期到10分钟(标准是30-60分钟)进行。
可替代地，如本文定义的半粗制油可以是粗制油和半粗制油的混合物。
本发明的实施方案涉及本发明的任何第一方面的方法，包括下面步骤：
i)调节食用油的温度到温度在25℃到70℃之间；
ii)通过加入含有至少85％水的水溶液0.5-6％(相对于油的重量)预处理食用油到上面调节的温度5-120分钟，其中所述的预处理之后没有接着除去油中的水合粘质和磷含量；
iii)调节水/油乳液的pH到pH1.5-8(例如，加入适当量的NaOH溶液)；
iv)将水/油乳液与磷脂酶水溶液接触(在根据步骤i)调节的温度(+/-5℃)下)，在油中乳化磷脂酶直到油中的磷含量降低到小于11ppm；
v)从处理的油中分离水相。
将上面步骤i)的食用油的温度优选地调节到用于本方法的酶的最佳磷脂酶活性温度。
对于商业可得的磷脂酶LecitaseTM(Novo Nordisk A/S)，这约是60℃，并且对于从丝状真菌镰孢属获得的本发明的磷脂酶，这约是45℃。参见本文的工作实施例以便进一步详细了解这一问题。
可以预见大多数丝状真菌磷脂酶将具有的最佳温度范围是35-50℃。
因此，本发明的实施方案涉及上面刚刚叙述的方法，其中将步骤i)中的食用油的温度调节到35-50℃之间的温度，从丝状真菌菌株获得用于步骤iv)的磷脂酶。
在上面的方法的步骤ii)中，通过加入含有至少85％水的水溶液0.5-6％(相对于油的重量)，在调节的温度(步骤i))预处理食用油5-120分钟，并且其中所述的预处理后没有接着除去油中的水合粘质和磷含量。
这一步骤是食用油的酶促脱胶中的标准的预处理步骤(美国专利5,264,367；美国专利5,558,781)。步骤ii)的目的是在食用油中水合可水合/亲水成分(如可水合磷含量)，当水合时，这些物质变成油中的不溶成分。
但是，这一步骤不同于本文中称为“食用油的水脱胶”的步骤。一个主要的差异是所述的预处理步骤没有从油中除去水合磷脂和粘质。从油中除去所述的水合内容物是食用油的水脱胶的主要目的。
因此，当将磷脂酶与上面的步骤iv)的油中接触时，油仍然含有所述的水合磷脂和粘质。
用另一句话说，如果食用油是非水脱胶食用油，上面的方法叙述了简化的酶促脱胶方法，该方法没有在将所述的油与磷脂酶接触之前从油中除去水合磷脂和粘质。
优选地，含有至少85％的水的水溶液(上面的步骤ii)进一步含有柠檬酸。优选地，在所述的水溶液中含有1-15％(w/w)柠檬酸，更优选地，在所述的水溶液中含有3-11％(w/w)的柠檬酸。
优选地，在步骤ii)中的时间是15-50分钟，更优选地15-30分钟。
涉及上面的步骤ii)中所述的预处理的更加详细的参考可以在本文的工作实施例中进行。
在上面的步骤iii)中，将水/油乳液的pH调节到pH1.5-8(例如，通过加入适当量的NaOH溶液)。这可以进行，目的是在磷脂酶与步骤iv)中的油接触之前调节油的pH值。通常，实际的最适pH值将取决于用于在步骤iv)中接触油的实际的酶。涉及这一问题的参考的详细情况在本文的工作实施例中说明。
通常，根据本发明的第一方面和它们的实施方案，所述的油与含有磷脂酶的水溶液的接触在pH1.5-6，更优选地在pH3-6时进行是优选的。
在油乳液中的水中的pH值是通过从油乳液取2毫升水并且与2毫升水混合进行测量的。在相分离后，得到的顶部油层用移液管吸走，并且在水相中测量pH。通过下面的公式pH真正＝pH测量-0.38将测量值转化成“真正”pH值。更加详细的参考在本文的工作实施例中说明。
优选地，在本发明的食用油中降低含磷成分的量的方法中，在油中乳化的磷脂酶的量的范围为0.1-15毫克酶(干物质)/千克油，更优选地0.25-5毫克酶(干物质)/千克油，和甚至更优选地0.25-2.5毫克酶(干物质)/千克油。
通常，将所利用的磷脂酶的量，和用于酶促脱胶食用油的时间最佳化，以便获得低于11ppm的磷内容物是有利的。真正的最适酶剂量和时间将取决于所利用的真正的磷脂酶。为了进一步详细了解关于该方法的酶剂量和时间的最佳化，在本文的工作实施例中说明了详细参考。
优选地，在本发明的降低食用油中含磷成分的量的方法中，在将所述的油与0.5-6毫克磷脂酶(干物质)/千克油接触后，油中的磷含量降低到小于11ppm，并且其中磷脂酶与所述的油的接触时间为1-6小时，更优选地，在将所述的油与0.25-2.5毫克磷脂酶(干物质)/千克油接触后，油中的磷含量降低到小于11ppm，并且其中磷脂酶与所述的油的接触时间为15分钟到2小时。
参见本文的工作实施例以便进一步详细了解个别磷脂酶的最适温度的鉴定。
优选地，在本发明的降低食用油中含磷成分的量的方法的所有方面和实施方案中，油中的磷含量降低到小于5ppm。
测量油中的磷含量以在油乳液中存在的水的油相中的份/百万(ppm)表示。根据“油，脂肪和衍生物的分析的标准方法，第7版(1987)”中方法2.421进行磷含量分析。本文的工作实施例进行了进一步的详细参考说明。
本发明的实施方案涉及本发明中降低食用油中的含磷成分的量的方法，其中从哺乳动物种获得磷脂酶，特别是，其中磷脂酶是从所述的哺乳动物种的胰脏获得的，最优选地，其中磷脂酶是从猪的胰中获得的。
优选地，在本发明的降低食用油中的含磷成分的量的方法中，磷脂酶是从微生物，优选地丝状真菌，酵母，或细菌中获得的。
优选地，当上面提到的所述丝状真菌是镰孢属内的种类时，优选的菌株是如大刀镰孢，异孢镰孢，茄病镰孢，或特别是尖孢镰孢的菌株。
另外，当上面的所述丝状真菌是曲霉属内的种类时，优选的菌株是如泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，黑曲霉或特别是米曲霉的菌株。
另外，在本发明的降低食用油中含磷成分的量的方法中，食用油优选地是大豆油，葵花籽油，或更优选地是菜籽油。
从尖孢镰孢获得的磷脂酶的鉴定
从尖孢镰孢获得的本发明的磷脂酶已经被广泛地鉴定了。
因此，优选地，本发明的一个方面是分离的磷脂酶A，该酶是从镰孢属的菌株获得的，并且在pH范围3-10，40℃测量时具有磷脂酶A活性，更优选地在40℃，pH范围3-7时测量具有磷脂酶A活性，更优选地，在40℃，pH范围3.5-6时测量具有磷脂酶A活性，甚至更优选地在40℃，pH4.5-5.5范围测量时具有磷脂酶A活性。
利用大豆卵磷脂作为底物(基于NEFA试验的测试)，或在含有2％卵磷脂，2％Triton X-100，20毫摩尔/升Britton-Robinson(BR)的缓冲液中测确定磷脂酶A活性，参见本文的工作实施例进一步了解详细情况。
在本发明的另一实施方案中，从镰孢属的菌株获得的分离的磷脂酶A优选地具有分子量29±10千道尔顿，更优选地具有分子量29±5千道尔顿，甚至更优选地具有分子量29±3千道尔顿，和最优选地具有分子量29±2千道尔顿。
正如在“材料和方法”部分中进一步的叙述(见下文)，通过SDS-PAGE电泳可以测量分子量。
在本发明的其它实施方案中，从镰孢属的菌株获得的分离的磷脂酶A优选地具有等电点(pI)的范围为4.5-8，更优选地等电点范围为5-7.5，和甚至更优选地等电点(pI)的范围为5.5-7.5。
利用来自Pharmacia的两性电解质PAGE平板确定等电点(pI)。参见本文的工作实施例以便进一步详细说明(见下文)。
在本发明的另一实施方案中，从镰孢属的菌株获得的分离的磷脂酶A优选地具有磷脂酶活性的最适温度范围为25-55℃。测量时利用卵磷脂作为底物，pH5；更优选地在范围为30-50℃，测量时利用卵磷脂作为底物，pH5，和更优选地范围为40-50℃，测量时利用卵磷脂作为底物和pH5。
在含有2％卵磷脂，2％Triton X-100，20毫摩尔/升BrittonRobinson缓冲液的缓冲液中，在pH5测量磷脂酶活性的最适温度。参见本文的工作实施例以便进一步详细说明(见下文)。
仍然在本发明的另一实施方案中，从镰孢属的菌株获得的分离磷脂酶A优选地在37℃，pH最适范围6-12；更优选地在37℃，pH范围为7-11.5；更优选地在37℃，pH范围为8-11；和更优选地在37℃，pH范围为8.5-11时具有磷脂酶活性。
在含有2％卵磷脂，2％Triton X-100，20毫摩尔/升Britton-Robinson(BR)的缓冲液中，在37℃确定磷脂酶活性pH最适范围。参见本文的工作实施例以便进一步详细说明。
优选地，本发明的磷脂酶至少具有上面提到的该酶的物理特征中的5个(编号i)到v))中的2个，更优选地，本发明的磷脂酶至少具有上面提到的该酶的物理特征的5个(编号i)到v))中的3个，甚至更优选地，本发明的磷脂酶至少具有上面提到的该酶的物理特征的5个(编号i)到v))中的4个，最优选地，本发明的磷脂酶具有上面提到的该酶的物理特征中所有5个(编号i)到v))。
如上所述，本发明的磷脂酶已经克隆，重组表达，纯化，并且已经确定了分泌的活性酶的N末端和C末端序列。
因此，本发明的其它实施方案涉及具有磷脂酶A活性的分离的多肽，该多肽是从镰孢属的菌株获得的，并且具有
I)在40℃时测量，在pH范围3-10中的PLA活性；
ii)如SDS-PAGE确定，分子量为29±10千道尔顿；
iii)等电点(pI)范围为4.5-8；
iv)磷脂酶活性的温度最适范围为25-55℃，测量时利用卵磷脂作为底物，pH5；和/或
v)磷脂酶活性pH最适值范围为6-12，测量时利用卵磷脂作为底物，37℃；
并且进一步包括选自包括下面多肽的组的氨基酸序列：
(a)克隆到存在于大肠杆菌DSM11299中的质粒pYES2.0的编码磷脂酶A酶的DNA序列部分编码的多肽；
(b)具有如SEQ ID NO：2的位置31-346显示的氨基酸序列的多肽；
(c)具有SEQ ID NO：2的位置31-303中显示的氨基酸序列的多肽；
(d)(a)，(b)或(c)中定义的多肽的类似物，至少与所述的多肽具有70％的同源性；和
(e)(a)，(b)，(c)或(d)的片段。
在本发明的一个实施方案中，具有本发明的磷脂酶活性的分离的多肽是具有磷脂酶A1活性的磷脂酶。
在其它实施方案中，具有本发明的磷脂酶活性的分离的多肽是具有磷脂酶A2活性的磷脂酶，甚至在其它实施方案中，具有本发明的磷脂酶活性的分离的多肽是具有磷脂酶B活性的磷脂酶。
优选地，所述的具有本发明的磷脂酶活性的分离的多肽是具有磷脂酶A1活性的磷脂酶。
对于测量单个PLA1，PLA2和/或PLB活性的标准技术的特异实施例，可以参考本文的工作实施例。
在本发明的其它实施方案中涉及了具有本发明的磷脂酶活性的分离的多肽，其中磷脂酶是在含有2％卵磷脂，2％Triton X-100，20毫摩尔/升柠檬酸，pH5的缓冲液中；在37℃温育10分钟，接着在95℃5分钟终止反应时测量从卵磷脂释放的游离脂肪酸的磷脂酶活性测试中，在5毫摩尔/升EDTA和5毫摩尔/升Ca2+时作为相对的磷脂活性而测定的基本独立于Ca2+浓度的磷脂酶的。其中在5毫摩尔/升EDTA/5毫摩尔/升Ca2+的相对磷脂酶活性的比例大于0.25，更优选地大于0.5，最优选地大于0.80。
涉及酶活性对Ca2+浓度的依赖的测量的其它细节参考本文的工作实施例。
一些脂酶可能具有有限的磷脂酶活性。在本文中，这样的所述脂酶的有限的磷脂酶活性定义为“具有磷脂酶副活性的脂酶”(参见“定义”部分)。本发明涉及具有磷脂酶活性的分离的多肽，其中所述的分离的多肽的磷脂酶活性如它的工业上适用的一样高。
因此，本发明涉及具有本发明的磷脂酶活性的分离的多肽，其中磷脂酶是具有磷脂酶活性的磷脂酶，其活性是至少0.25纳摩尔/分钟，酶剂量60微克，25℃；更优选地至少0.40纳摩尔/分钟，酶剂量：60微克，25℃；在单层磷脂酶测试中测量如下：
a.在缓冲溶液(10毫摩尔/升TRIS，pH8.0，25℃)的完全纯化的表面的单层仪器(零级通过(zero-order through))，从氯仿溶液铺一个磷脂单层DDPC(Di Dicanoyl(C10)磷脂酰胆碱)。
b.在单层松弛后(蒸发氯仿)，调节表面压力到10mN/m，对应的DDPC的平均分子面积是约632/分子；
c.含有60微克酶的缓冲溶液(如上所述)通过单层注射进入在“零级通过”中的反应舱(面积1520平方毫米和30400立方毫米的圆筒)的面下相。
d.通过压缩单层的可动屏障的速度确定酶活性以便维持恒定的表面压力，因为不溶底物分子水解成更加可溶于水的反应产物，其中从DDPC的平均分子面积(MMA)估计酶每分钟水解的DDPC分子的数目。
参见“定义”部分和本文的工作实施例以便进一步说明本发明的具有磷脂酶活性的分离的多肽的磷脂酶活性的优选的量。
另外，通过已知的标准磷脂酶活性测试可以测量本发明的磷脂酶的特异的磷脂酶活性。
因此，在本发明的进一步实施方案中，涉及具有本发明的磷脂酶活性的分离的多肽，其中磷脂酶是具有能够释放至少7微摩尔游离脂肪酸/分钟/毫克酶，更优选地，至少15微摩尔游离脂肪酸/分钟/毫克酶；甚至更优选地，至少30微摩尔游离脂肪酸/分钟/毫克酶，和最优选地至少50微摩尔游离脂肪酸/分钟/毫克酶的磷脂酶活性的磷脂酶，磷脂酶活性测量如下：
在含有2％卵磷脂，2％Triton X-100，20毫摩尔/升柠檬酸，pH5的缓冲液中；在测量从卵磷脂释放游离脂肪酸的测试中，在37℃温育10分钟。接着在95℃5分钟终止反应，测量磷脂酶活性。
涉及本发明的这一实施方案的其它细节参考本文的工作实施例。
具有本发明的磷脂酶活性的分离的多肽是非常适于进行食用油的酶促脱胶的。
因此，本发明涉及：
1.具有本发明的磷脂酶活性的分离的多肽，其中根据本发明的方法，磷脂酶能够进行食用油的酶促脱胶，以便降低至少含有50ppm的非水合磷含量的食用油中含磷成分的量；和
2.具有本发明的磷脂酶活性的分离的多肽，其中磷脂酶能够进行水脱胶食用油(具有磷含量50-250ppm)的酶促脱胶，因此降低了油中的磷含量到小于11ppm，其中酶促脱胶过程包括将所述的油在pH1.5-8下与磷脂酶的水溶液接触，磷脂酶的水溶液在油中乳化，直到油的磷含量小于11ppm，然后从处理的油中分离水相。
优选地，具有本发明的磷脂酶活性的分离的多肽能够在小于1.5小时的时间内进行所述的水脱胶食用油(上面刚定义)的酶促脱胶过程，并且利用少于2毫克磷脂酶(干物质)/千克油。
优选地，从镰孢属内的丝状真菌菌株获得显示磷脂酶活性并且具有本发明上面显示的特征的分离的多肽。
但是，不受任何理论的限制，目前受到关注的是本发明的磷脂酶也可以从另一个微生物，优选地另一个丝状真菌菌株获得。其实例在“微生物来源”部分给出(见下文)。
克隆的DNA序列
尽管存在许多技术困难(参见部分“克隆丝状真菌磷脂酶的方案”见下文)，本发明人已经能够从镰孢属菌株，更具体地尖孢镰孢的菌株克隆显示PLA活性的磷脂酶。
另外，目前相信根据本申请书提供的序列信息，克隆相关的磷脂酶A和/或磷脂酶B编码DNA序列都是可能的。
因此，本发明一个方面涉及克隆编码显示磷脂酶A和/或磷脂酶B活性的酶的DNA序列，DNA序列选自包括下面的组：
(a)克隆到存在于大肠杆菌DSM11299的质粒pYE2.0的多聚核苷酸的编码磷脂酶A的部分；
(b)SEQ ID NO：1的位置23-1063，更优选地SEQ ID NO：1的位置113-1063，或甚至更优选地SEQ ID NO：1的位置113-929所示的DNA序列，或它的互补链；
(c)与(a)或(b)中定义的所述DNA序列至少70％同源的DNA序列；
(d)(a)或(b)中定义的DNA序列，编码显示磷脂酶活性的多肽，并且与SEQ ID NO：2的位置31-346显示的多肽序列至少70％同源性，或更优选地与SEQ ID NO：2的位置31-303显示的多肽序列至少70％的同源性。
(e)在低严格性条件下，与含有SEQ ID NO：1中的位置23-1063显示的DNA的双链DNA探针杂交的DNA序列；
(f)编码具有SEQ ID NO：2的残基1-346，31-346或31-303的氨基酸序列或(e)的任何DNA序列编码的氨基酸序列的多肽的DNA序列；和
(g)(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)所示的DNA序列的片段的DNA序列。
在本说明书中，每当参考是针对克隆到DSM11299的质粒pYES2.0的DNA序列的磷脂酶的编码部分的，这样的参考也打算包括存在于SEQ ID NO：1的DNA序列的磷脂酶编码部分。
因此，可以相互交换使用术语“克隆到存在于DSM11299的质粒pYES2.0的DNA序列的磷脂酶编码部分”和“存在于SEQ ID NO：1中的DNA序列的磷脂酶编码部分”。
DNA序列可以是基因组，cDNA，或合成起源或其任何联合。
本发明也包括编码显示磷脂酶A和/或磷脂酶B活性的酶的克隆DNA序列，该酶具有SEQ ID NO：2的成熟部分阐述的氨基酸序列，借助于遗传密码的简并性，与SEQ ID NO：1相区别。
从产生具有磷脂酶活性的酶的丝状真菌尖孢镰孢，或如下所述的另一个或相关生物体(参见，“微生物来源”部分)的菌株可以克隆SEQ ID NO：1显示的DNA序列和/或本发明的DNA序列的类似物。
可替代地，在以SEQ ID NO：1的磷脂酶编码部分，例如作为其亚序列存在的DNA序列的基础上可以类似序列，和/或通过导入核苷酸取代构建而构建，这些取代不引起yynwDNA序列编码的磷脂酶的另一个氨基酸序列，但对应于打算产生该酶的宿主生物体的密码使用，或通过导入可能产生的不同的氨基酸序列的核苷酸取代而构建(即，本发明的磷脂酶突变体)。
当进行核苷酸取代时，氨基酸改变优选地是次要的性质，即，保守氨基酸取代，它不明显地影响蛋白质的折叠或活性；小的缺失，通常一个到约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延长，如氨基末端甲硫氨酸残基；高达约20-25个残基的小接头肽；或小的延长，能够便于纯化，如多聚组氨酸序列；抗原表位或结合区域。
保守取代的例子是在碱性氨基酸，如精氨酸，赖氨酸，组氨酸；酸性氨基酸，如谷氨酸和天冬氨酸；极性氨基酸，如谷氨酰胺和天冬酰胺；疏水氨基酸，如亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸；芳香氨基酸，如苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸；和小的氨基酸，如甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸的组内的。核苷酸取代的一般叙述可以参见Ford等人，(1991)，蛋白质表达和纯化2，95-107。
本领域技术人员将明了的是这样的取代可以在分子的功能的关键区的外面进行，并且仍然产生活性多肽。根据本领域已知的过程，如位点特异的诱变或丙氨酸扫描诱变可以鉴定本发明的克隆DNA序列编码的多肽的活性的关键的和因此优选地不进行取代的氨基酸(参见例如，Cunningham和Wells，(1989)，科学244，1081-1085)。在后面的技术中，在分子的每个残基中导入突变，并且测试得到的突变分子的生物活性(即磷脂酶)以便鉴定分子活性的关键氨基酸残基。通过核磁共振分析，晶体学，或光亲和标记这样的技术确定的晶体结构的分析也可以确定底物-酶相互作用的位点(参见，例如de Vos等人(1992)，科学255，306-312；Smith等人，(1992)，分子生物学杂志，224，899-904；Wlodaver等人，(1992)，FEBS通讯，309，59-64)。
本发明的多肽也可以包括融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一个多肽在多肽或其片段的N末端或C末端融合。通过融合编码另一个多肽的核酸序列(或其部分)与本发明的核酸序列(或其部分)产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，以便它们在框架内，并且使融合多肽的表达在同样的启动子和终止子的控制下。
利用标准克隆技术例如Sambrook等人(1989)，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约中所述，从大肠杆菌DSM11299的菌株可以克隆本发明的DNA序列。
因为本发明人已经解决了开发用于表达克隆技术的适当的筛选测试以便克隆本发明的磷脂酶的问题，参见标题为“克隆丝状真菌磷脂酶的方案”的开头分，现在本发明的DNA序列可以通过任何一般的方法克隆，该方法包括
. 在适当的载体中克隆来自于预期产生需要的磷脂酶的任何生物体的cDNA文库，
. 利用所述的载体转化适当的酵母宿主细胞，
. 在适当的条件下培养宿主细胞以便表达cDNA文库中的克隆编码的需要的任何酶，
. 通过确定这样的克隆产生的酶的任何磷脂酶活性筛选阳性克隆，和
. 从这样的克隆分离编码酶的DNA。
可替代地，因为本发明第一次提供了编码丝状真菌PLA酶的克隆的DNA序列，根据已知的技术，编码本发明的磷脂酶的DNA可以方便地从适当的来源克隆，如任何“微生物来源”部分提到的任何生物体，其中利用了在本文公开的DNA序列的基础上制备的合成寡聚核苷酸探针。例如，可以在作为SEQ ID NO：1提供的核苷酸序列的磷脂酶编码部分或其任何适当亚序列的基础上，或SEQ IDNO：2的氨基酸序列的基础上制备适当的寡聚核苷酸探针。
另外，因为本发明的克隆DNA序列编码了具有本发明的磷脂酶活性的多肽，许多特异的实施方案涉及具有本发明的磷脂酶活性的分离的多肽，也是本发明的编码具有磷脂酶活性的多肽的本发明的克隆DNA序列的实施方案。结果是，所述的具有磷脂酶活性的分离的多肽的参考和优选的和最优选的实施方案同样涉及本发明的克隆DNA序列。
因此，本发明的实施方案涉及根据本发明克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列编码的磷脂酶是磷脂酶A1。
在其它实施方案中，本发明的克隆序列是克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列编码的磷脂酶是磷脂酶A2，并且甚至在另一个实施方案中，本发明的克隆序列是克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列编码的磷脂酶是磷脂酶B。
优选地，本发明的所述克隆DNA序列编码具有磷脂酶A1活性的多肽。
另外，本发明涉及根据本发明克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列编码的磷脂酶是基本独立于Ca2+浓度的磷脂酶，其测量如下：
在含有2％卵磷脂，2％Triton X-100，20毫摩尔/升柠檬酸，pH5的缓冲液中进行的磷脂酶活性测试中；在5毫摩尔/升EDTA和5毫摩尔/升Ca2+时，在37℃温育10分钟，接着在95℃5分钟终止反应后测量从卵磷脂释放的游离脂肪酸而测量相对磷脂酶活性。其中在5毫摩尔/升EDTA/5毫摩尔/升Ca2+的相对磷脂酶活性的比例大于0.25，更优选地比例大于0.5。
甚至进一步，本发明涉及根据本发明克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列编码的磷脂酶是具有至少0.25纳摩尔/分钟，酶剂量：60微克，25℃；更优选地至少0.40纳摩尔/分钟，酶剂量：60微克，25℃；的磷脂酶活性的磷脂酶，在单层磷脂酶测试中如下进行测量：
a.在缓冲溶液(10毫摩尔/升TRIS，pH8.0，25℃)的完全纯化的表面的单层仪器(零级通过)，在氯仿溶液中铺一个磷脂DDPC(DiDicanoyl(C10)磷脂酰胆碱)的单层。
b.在单层松弛后(蒸发氯仿)，调节表面压力到10mN/m，对应的DDPC的平均分子面积是约632/分子；
c.含有60微克酶的缓冲溶液(如上所述)通过单层注射进入在“零级通过”的反应舱(面积1520平方毫米和30400立方毫米的滚筒)的面下相。
d.通过压缩单层的可动屏障的速度确定酶活性以便维持恒定表面压力，因为不溶底物分子水解成更加可溶于水的反应产物，其中从DDPC的平均分子面积(MMA)估计酶每分钟水解的DDPC分子的数目。
在本发明的其它实施方案中涉及了根据本发明克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列编码的磷脂酶是具有能够释放至少7微摩尔游离脂肪酸/分钟/毫克酶；更优选地至少15微摩尔游离脂肪酸/分钟/毫克酶的磷脂酶活性的磷脂酶；测量如下：
在含有2％卵磷脂，2％Triton X-100，20mM柠檬酸，pH5的缓冲液，在37℃温育10分钟，接着在95℃5分钟终止反应的测试中测量从卵磷脂释放的游离脂肪酸而测量磷脂酶活性。
在本发明的其它实施方案中涉及：
根据本发明克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列编码的磷脂酶能够根据本发明的方法进行食用油的酶促脱胶以便降低含有非水合磷含量至少50ppm的食用油中的含磷成分的量；和
根据本发明克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列编码的磷脂酶能够进行水脱胶食用油(具有磷含量50-250ppm)的酶促脱胶，因此降低油中的磷含量到小于11ppm，其中酶促脱胶过程包括将所述的油在pH1.5-8与磷脂酶的水溶液接触，这一水溶液在油中乳化直到油的磷含量降低到小于11ppm，然后从处理的油中分离水相。
优选地，根据本发明克隆的DNA序列是克隆的DNA序列，其中所述的DNA序列编码的磷脂酶能够通过利用小于2毫克磷脂酶(干物质)/千克油进行水脱胶食用油的酶促脱胶过程，并且其中磷脂酶与所述的油接触15分钟到2小时的时间。
克隆丝状真菌磷脂酶的方案
当尝试分离本发明的磷脂酶或克隆编码它的多聚核苷酸时，遇到许多技术困难。分离酶似乎是不可能的，并且研究了多聚核苷酸的克隆的问题。
如本文所述，过去不能得到编码丝状真菌磷脂酶A的DNA序列。因此，本发明人在酵母技术中表达克隆的基础上研制了克隆方案(H.Dalboege等人，分子遗传学(1994)243：253-260；WO93/11249；和WO94/14953)。
这一技术遇到的一个主要的问题是酵母在平板测试产生了产生磷脂酶背景的内部活性。发现这一背景高度依赖于测试平板中底物的量，所以，底物的量不得不小心地滴定到背景足够低的水平，该水平使测试在表达克隆筛选过程中是可靠的，该水平也足够高到能够发生反应。
另外，通常丝状真菌菌株包括许多不同的脂酶，其中一些甚至显示了有限的磷脂酶活性。这样的脂酶本文定义为“具有磷脂酶副活性的脂酶”(参见本文的“定义”部分)。
在平板测试中，也发现具有磷脂酶副活性的这样的脂酶背景是高度依赖于测试平板中底物的量的，因此底物的量不得不更小心地滴定以便消除具有磷脂酶副活性的酵母细胞和丝状真菌脂酶的背景活性。
此外，发现不得不小心选择底物，因为在这一问题上许多不提供任何有效的溶液，因为许多测试的磷脂酶底物给出背景活性，因为没有磷脂酶活性的脂酶能够与底物反应。因此，不得不测试和滴定许多底物以便鉴定适当的底物。
发现使进行编码磷脂酶的多聚核苷酸的表达克隆成为可能的溶液是利用小心检测浓度的Lipoid E80(来自Lipoid GmbH)。在本文的材料和方法部分，公开了酵母方案中完全表达克隆的详细说明，包括解决上面叙述的问题的平板测试。
DNA序列的同源性/同一性
上面提到的DNA序列的同源性/同一性确定为两个序列之间的同一性程度，表明了第一个序列与第二个序列之间的偏差。通过本领域已知的计算机程序可以适当确定同源性，如GCG程序包装中提供的GAP(Wisconsin包装的程序手册，第8版，1994年8月，遗传计算机集团，575 Science Drive，麦迪生，成斯康星，美国53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)，分子生物学杂志，48，443-453)。利用GAP，以及下面的设定用于DNA序列比较：GAP产生罚分为5.0，和GAP延长罚分为0.3，DNA序列的编码区显示优选地至少70％的程度，更优选地至少80％，更优选地至少90％，更优选地至少95％，更优选地至少97％与SEQ ID NO：1显示的DNA序列的磷脂酶编码部分(即SEQ ID NO：1的位置23-1063)的同一性；或更优选地与SEQ ID NO：1的位置113-1063显示的DNA序列的同一性(位置113对应于成熟酶的N末端残基)；或甚至更优选地与SEQ ID NO：1中位置23-929显示的DNA的同一性(位置929对应于C末端加工分泌的活性酶中的C末端残基)。
杂交
上面提到的杂交是打算包括与对应于SEQ ID NO：1中显示的DNA序列，即核苷酸23-1063的磷脂酶编码部分的双链DNA探针，或更优选地与对应于SEQ ID NO：1中位置113-1063(位置113对应于成熟酶的N末端残基)显示的DNA序列的双链DNA探针；或甚至更优选地与对应于SEQ ID NO：1中位置23-929(位置929对应于在C末端加工的分泌活性酶的C末端残基)显示的DNA序列的双链DNA探针，至少在如下详细叙述的低严格性条件下杂交的类似DNA序列。
在低，中度，或高严格性时确定核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间杂交的适当实验条件包括预先在5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等人，1989)浸泡含有杂交的DNA片段或RNA的滤膜10分钟，在5×SSC，5×Denhardt溶液(Sambrook等人，1989)，0.5％SDS和100微克/毫升超声变性的鲸精子DNA(Sambrook等人1989)的溶液中预杂交滤膜，接着在同样的含有10纳克/毫升任意引导(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)生物化学年评，132：6-13)，32P-dCTP标记(特异活性＞1×109cpm/微克)探针的溶液中杂交12小时，平均温度45℃。然后，在2×SSC，0.5％SDS，在至少55℃(低严格性)，更优选地至少60℃(中度严格性)，仍然更优选地至少65℃(中度/高严格性)，甚至更优选地至少70℃(高严格性)，甚至更优选地至少75℃(非常高严格性)的温度下洗涤滤膜30分钟两次。
利用X射线胶片检测在这些条件下与寡聚核苷酸探针杂交的分子。
已经发现理论预测是否两个给定的DNA序列在一定的特异条件下杂交是可能的。
因此，作为上面叙述的实验方法的替代，确定是否类似DNA序列将与上面叙述的的核苷酸探针杂交可以是基于Tm(熔解温度)的理论计算的，在该温度下两个异源DNA序列与已知序列将在特异条件(例如，有关阳离子浓度和温度)下杂交。
为了确定异源DNA序列的熔解温度(Tm(异源))，必须首先确定同源DNA的熔解温度(Tm(同源))。
利用下面的公式可以确定两个完全互补DNA链(形成同源双链体)之间的熔化温度(Tm(同源))：
Tm(同源)＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L(“分子生物学中的现代方案”John Wiley和Sons，1995)，其中
“M”指洗涤缓冲液中的摩尔阳离子浓度，
“％GC”：DNA序列中的碱基总数的鸟嘌啉(G)和胞嘧啶(C)的百分数，
“％form”：在洗涤缓冲液中甲酰胺的百分数，和
“L”：DNA序列的长度。
利用这一公式和上面给出的实验洗涤条件，对应于SEQ ID NO：1显示的DNA序列，即核苷酸23-1060的核苷酸探针的同源双链体的Tm(同源)是：
Tm(同源)＝81.5+16.6(log0.30)+0.41(56)-0.61(0)-(500/1038)
Tm(同源)＝103.5℃
“M”：对应于阳离子浓度0.3M的2×SSC。
“％GC”：在SEQ ID NO：1位置23-1060中的％GC是56％。
“％form”：在洗涤缓冲液中没有甲酰胺。
“L”：SEQ ID NO：1位置23-1063 1038bp的长度。
上面的公式确定的Tm是在两个完全互补的DNA序列之间同源双链体形成的Tm(Tm(同源))。为了使Tm值适用于两个异源DNA序列，假设在两个异源序列之间核苷酸序列1％的差异等于在Tm下降1℃(“分子生物学当前方案”，John Wiley和Sons，1995)。所以，发现异源双链体形成的Tm(异源)是从Tm(同源)减去问题中的类似序列与上面所述的核苷酸探针之间的同源性(％)的差。如本文所述计算减去的DNA同源性百分数(出处同上)。
氨基酸序列的同源性
上面提到的多肽同源性确定为两个序列之间的同一性程度，表明第一个序列和第二个序列之间的差异。通过本领域已知的计算机程序如GCG程序包中提供的GAP(威斯康星包的程序手册，第8版，1994年8月，遗传学计算机集团，575 Science Drive，麦迪生，威斯康星，美国53711)可以适当确定同源性(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)，分子生物学杂志，48，443-453。利用GAP以及下面的设置用于多肽序列的比较：
GAP产生罚分3.0，GAP延长罚分0.1，类似DNA序列编码的多肽的成熟部分显示了与SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列的成熟部分即，SEQ ID NO：2中位置31-346，或更优选地与SEQ ID NO：2的位置31-303中显示的氨基酸序列(位置303是C末端加工的分泌的活性酶的C末端残基)具有至少70％的同一性，更优选地至少80％，更优选地至少90％，更优选地至少95％，特定的至少97％。
本发明也涉及与具有与SEQ ID NO：2中阐述的氨基酸序列的成熟部分区别不超过3个氨基酸优选地不超过2个氨基酸，更优选地不超过1个氨基酸的氨基酸序列的磷脂酶变异体。
另外，上面提到的优选的氨基酸同一性也涉及本发明的克隆的DNA序列类似物，该序列编码显示磷脂酶活性的多肽，它与SEQ IDNO：2的位置31-346显示的多肽序列至少70％的同源性，或更优选地与含有SEQ ID NO：2的位置31-303的多肽序列至少70％的同源性。
免疫交叉反应性
通过利用纯化的磷脂酶可以制备用于确定免疫交叉反应性的抗体。更具体地说，根据N.Axelsen等人在定量免疫电泳的手册，Blackwell科学出版社，1973，23章，或A.Johnstone和R.Thorpe，实践中的免疫化学，Blackwell科学出版社，1982(更具体地说，27-31页)叙述的过程可以通过免疫接种兔可以产生抗本发明的磷脂酶的抗血清。从获得的抗血清，例如通过盐沉淀((NH4)2SO4)，接着透析和离子交换层析，例如，在DEAE-葡聚糖凝胶上可以获得纯化的免疫球蛋白。通过Outcherlony双扩散分析(O.Ouchterlony：在实验免疫学手册(D.M.Weir编辑)，Blackwell科学出版社，1967，655-706页)，通过交叉免疫电泳(N.Axelsen等人，出处同上，3章和4章)，或通过火箭免疫电泳(N.Axelsen等人，第2章)可以进行蛋白质的免疫化学鉴定。
微生物来源
在本发明的优先权日期，下面应用的分类学根据是World WideWeb(www)NCBI分类学分支。
从任何微生物，优选地丝状真菌，酵母细胞或细菌可以获得本发明的具有磷脂酶活性的分离的多肽和对应的本发明的克隆的DNA序列。
优选地，从丝状真菌菌株可以获得本发明的磷脂酶和对应的克隆的DNA序列，其中优选的门是子囊菌门(Ascomycota)，其中优选的纲是核菌纲(Pyrenomycetes)，包括优选的科Nectriaceae。
更优选地，从镰孢属菌株，如大刀镰孢，异孢镰孢，或茄病镰孢，特定的尖孢镰孢的菌株可以获得本发明的磷脂酶和对应的克隆的DNA序列。
另外，从曲霉属内，如泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，黑曲霉或特别是米曲霉的丝状真菌菌株可以获得本发明的磷脂酶和对应的克隆的DNA序列。
根据为了专利程序的目的的国际公认的微生物保藏的布达佩斯条约，可以获得本发明的磷脂酶的尖孢镰孢的菌株的分离物已经保藏在德国微生物和细胞培养物保藏有限公司，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国联邦共和国，(DSM)。
保藏日期：1983年6月6日
保藏人号： NN041759
DSM号：尖孢镰孢DSM No.2672
另外，含有编码本发明的磷脂酶的全长cDNA序列的表达质粒pYES2.0已经转化进入大肠杆菌菌株，该菌株根据为了专利程序的目的的国际公认的布达佩斯条约保藏在德国微生物和细胞培养物保藏有限公司，Mascheroder Weg lb，D38124 Braunschweig，德国联邦共和国(DSM)。
保藏日期：1996年11月25日
保藏人号： NN049279
DSM号：大肠杆菌DSM No.11299
表达载体
本发明的表达载体可以是常规进行重组DNA过程的任何表达载体，载体的选择经常取决于载体待导入的宿主细胞。所以，载体可以是自动复制的载体，即，作为染色体外的整体存在的载体，它的复制是独立于染色体的复制，例如质粒。可替代地，载体可以是当导入宿主细胞时整合进入宿主细胞基因组并且与已经整合的染色体一起复制的载体。
在表达载体中，编码磷脂酶的DNA序列应该可操作地连接适当的启动子和终止子序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性并且起源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的任何DNA序列。用于连接编码磷脂酶的DNA序列，启动子和终止子并且将它们插入适当的载体的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如Sambrook等人(1989)，分子克隆，实验室手册，冷泉港纽约)。
用于丝状真菌宿主细胞的适当的启动子的例子是例如ADH3启动子(McKnight等人，EMBO J.4(1985)，2093-2099)或tpiA启动子。其它有用的启动子的例子是起源于编码米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定α淀粉酶，黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gluA)，Rhizomucor miehei脂酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶的基因的那些。
宿主细胞
本发明也涉及含有本发明的核酸序列的重组宿主细胞，这些细胞可以有利地用于重组生产多肽。术语“宿主细胞”包括由于复制过程中发生的突变而与亲本不同的任何亲本细胞的子代。
该细胞优选地利用含有本发明的核酸序列的载体转化，然后将载体整合进入宿主染色体。
“转化”指在宿主细胞中导入含有本发明的核酸序列的载体，以致载体保持为与染色体整合或作为自我复制的染色体外的载体。整合通常认为是优选的，因为核酸序列似乎在细胞中更加保持稳定。载体整合进入宿主染色体可以通过如上所述的同源或非同源重组发生。
在优选的实施方案中，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”如本文所用包括子囊菌门，担子菌门，壶菌门，和结合菌门(如Hawksworth等人，在真菌的Ainsworth和Bisby的词典，8版，1995，CAB国际公开，大学出版社，Cambridge，英国)以及卵菌门(如Hawksworth等人，1995，出处同上，171页引证)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，出处同上)。子囊菌门的代表组包括例如Neurospora，Eupenicillium(＝青霉属)，Emericella(＝曲霉属)，Eurotium(＝曲霉属)，和上面列出的真正的酵母。担子菌门的例子包括蘑菇，锈菌和黑粉菌。壶菌门的代表例子包括例如，Allomyces，Blastocladiella，Coelomomyces，和水生真菌。卵菌门的代表例子包括例如水霉水生真菌(水霉)如Achlya。有丝分裂孢子真菌的例子包括曲霉属，青霉属，假丝酵母属，和链格孢属。结合菌门的代表组包括例如根霉和毛霉。
在优选的实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括Eumycota和Oomycota亚门的所有丝状形式(如Hawkswirth等人，1995，出处同上定义)。通过营养菌丝鉴定丝状真菌，营养菌丝由几丁质，纤维素，葡聚糖，脱乙酰几丁质，甘露聚糖，和其它复合多糖组成。营养菌丝的生长是通过菌丝延长和专性需氧的碳代谢。相反，酵母如啤酒酵母的营养菌丝的生长是通过单层菌体的发芽并且碳代谢可以是发酵的。在更优选地实施方案中，丝状真菌的宿主细胞是下面种类，但不限于支顶孢属，曲霉属，镰孢属，腐质酶属，毛霉属，毁丝霉属，链孢霉属，曲霉属，草根霉属，Tolypocladium，和木霉属或有性型(teleomorph)或其同义物的种类。甚至在更优选实施方案，丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞。在另一个更优选的实施方案，丝状真菌宿主细胞是支顶孢属细胞。甚至在另一个更优选的实施方案，丝状真菌宿主细胞是镰孢属细胞。甚至在另一个更优选实施方案中，丝状真菌宿主细胞是腐质酶属细胞。甚至在另一个更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是毛霉属细胞。甚至在另一个更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是毁丝霉属细胞。甚至在另一个更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是链孢霉属细胞。甚至在另一个更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是青霉属细胞。甚至在另一个更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是草根霉属细胞。甚至在另一个更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Tolypoclakium细胞。甚至在另一个更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是木霉属细胞。在最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Discolor部分的镰孢属细胞(也已知为镰孢部分)。在另一个优选的实施方案中，丝状真菌亲本细胞是Elegans部分的镰孢属菌株，例如尖孢镰。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens或Thermomyces lanuginosa细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Rhizomucor miehei细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Myceliophthora thermophilum细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是粗糙链孢霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是产紫青霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Thielavia terrestris细胞。在另一个最优选的实施方案中，木霉细胞是Trichoderma harzianum，康宁氏木霉，Trichoderma longibrachiatum，Trichoderma reesei或绿色木霉细胞。
可以通过一些方法转化真菌细胞，包括原生质体的形成，原生质体转化，和以已知的方式再生细胞壁。曲霉宿主细胞的转化的适当过程叙述在EP238 023和Yelton等人，1984，美国科学院年报81：1470-1474。转化镰孢属种类的适当方法叙述在Malardier等人，1989，基因78：147-156或在审的美国专利申请系列号08/269,449。利用Becker和Guarente，在Abelson，J.N.和Simon，M.I.编辑的酵母遗传学和分子生物学指导，酶学方法，194卷，182-187，学术出版社，纽约；Ito等人，1983，细菌学杂志，153：163；和Hinnen等人，1978，美国科学院年报，75：1920中叙述的方法可以转化酵母。通过Graham和Van der Eb(1978，病毒学52：546)的磷酸钙沉淀方法直接吸收可以转化哺乳动物细胞。
生产磷脂酶的方法
本发明提供了生产本发明的分离的酶的方法，其中已经利用编码酶的DNA序列转化的适当的宿主细胞，在允许生产的酶的条件下培养，从培养物中回收得到的酶。
当将含有编码酶的DNA序列的表达载体转化到异源宿主细胞，异源重组生产本发明的酶是可能的。
因此，获得高度纯化的无同源杂质的磷脂酶组分是可能的。
在本发明中，同源宿主细胞可能是尖孢镰孢的菌株。
用于培养转化宿主细胞的培养基可能是任何适用于生长需要的宿主细胞的常规培养基。表达的磷脂酶通常可能分泌到培养基，可以通过已知方法包括通过离心或过滤从培养基分离的细胞，通过盐如硫酸铵沉淀培养基的蛋白质成分，接着层析如离子交换层析，亲和层析或诸如此类从中进行回收。
磷脂酶的应用
除了在本发明的新方法中将磷脂酶用于含有高量的非水合磷酸的食用油的酶促脱胶，许多其它磷脂酶的用途是本领域已知的。
这样的本领域已知磷脂酶的用途/应用如下所述。
本发明的磷脂酶可以用于需要水解磷脂或溶血磷脂如卵磷脂或溶血卵磷脂的脂酰基团的任何应用中。磷脂酶优选地在pH3-10和30-70℃(特别是40-60℃)使用。如果需要，可以在进行热处理如pH7，80℃1小时，或90℃10分钟反应后失活磷脂酶。
作为例子，本发明的磷脂酶可以用于制备生面团，面包和蛋糕，例如提高面包或蛋糕的弹性。所以，磷脂酶可用于生产面包的方法，包括在生面团的成分中加入磷脂酶，揉捏生面团和烘烤生面团生产面包。这可以利用美国专利4,567,046(Kyowa Hakko)，JP-A60-78529(QP公司)，JP-A62-11629(QP公司)，JP-A63-258528(QP公司)，或EP426211(Unilever)的类似方法进行。
通过利用磷脂酶处理本发明的磷脂酶也可以用于提高碳水化合物起源的水溶液或浆料的可过滤性。这特别可用于含有淀粉水解产物特别是小麦淀粉水解产物的溶液或浆料，因为它趋向于难于过滤并且得到浊的过滤物。在类似EP219,269(CPC International)中可以进行该处理。
另外，本发明的磷脂酶可以用于部分水解磷脂，特别是卵磷脂，以便获得改良的磷脂乳化剂。在涉及这一用途的LecitaseTM(NovoNordisk A/S)的生产页中，和在工业化学的Ullmann的百科全书(出版社：VCH Weinheim(1996))中进一步叙述的这一应用。
另外，本发明的磷脂酶可用于生产动物饲料的过程，包括混合磷脂酶与食物和至少一种磷脂。这可以在EP743 017的类似方法中可以进行。
根据本领域已知的方法使植物油/食用油脱胶
根据本领域已知的方法，本发明的磷脂酶可用于降低食用油中磷脂的含量的过程，包括利用磷脂酶处理油以便水解磷脂的主要部分，并且从油中分离含有水解的磷脂的水相。这一过程可用于纯化含有磷脂的任何食用油，例如植物油如大豆油，油菜籽油和葵花油。
在酶处理之前，优选地预处理植物油以便除去粘质，例如通过湿精炼。通常，在利用磷脂酶处理的开始时，油将含有50-250ppm的磷脂形式的磷，本发明的过程可以降低这一值到低于11ppm，更优选地低于5ppm。
通过分散磷脂酶的水溶液，优选地成为平均直径低于10微米的小滴进行酶处理。水和油的量的重量关系优选地是0.5-5％。可以非强制性地加入乳化剂。应用机械搅拌维持乳化状态。
在pH范围1.5-8可以进行酶处理。通过加入柠檬酸，柠檬酸缓冲液或HCl可以调节pH。
适当的温度通常是30-70℃(特别是40-60℃)。反应时间通常是0.5-12小时(例如，2-6小时)。适当的酶剂量通常是100-5000IU每升油，特别是200-2000IU/升。
酶处理可以分批进行，例如在搅拌的筒中，或它可以连续地，例如系列搅拌筒反应器。
酶处理后接着分离水相和油相。通过常规方法例如离心可以进行这一分离。
在其它方面，根据本领域已知的原理可以进行该过程，例如在美国5,264,367的类似方法(Metallgesell schaft，Rohm)；K.Dahlke和H.Buchold，INFORM，6(12)，1284-91(1995)；H.Buchold，脂肪科学技术95(8)，300-304(199 3)；JP-A2-153997(Showa Sangyo)；或EP654,527(Metallgesellschaft，Rohm)。
本发明的磷脂酶在焙烤中的应用
本发明的磷脂酶也可以用于改良面包的添加剂，例如生面组合物，生面添加剂，生面团调节剂，预混合物，和在生产面包和其它烘烤产品的过程中通常加入面粉和/或生面团的类似的制剂以便提供面包或其它烘烤产品改良的特性。
所以，本发明的实施方案涉及改良面包和/或改良生面团的组合物，并且另外涉及本发明的磷脂酶在这样的组合物的应用，和涉及含有本发明的改良面包和/或改良生面团的组合物的生面团或烘烤产品。
在本文中，术语“改良面包的组合物”和“改良生面团的组合物”打算表示除了酶成分可以包括其它通常用于烘烤以便改良生面团和/或烘烤产品的特性的其它物质的组合物。这样的成分的例子在下面给出了。
在本文中，术语“改良的特性”打算表示可以通过本发明的磷脂酶的作用改良的任何特性。特别是，磷脂酶的利用导致体积的增加和面包瓤结构的改良和烘烤产品的烘烤产品的抗老化特性，以及增加强度，稳定性和粘度降低并且因此改良生面团的机械加工性。已经发现当利用质量差的面粉时对生面团的效果特别好。提高机械加工性在与待机械加工的生面团的关系中特别重要。
通过与没有加入本发明的磷脂酶制备的生面团和/或烘烤产品比较可以评估改良的特性。
本发明的面包和/或生面团改良组合物可以进一步含有另一种酶。其它酶的例子有纤维素酶，半纤维素酶，戊聚糖酶(用于增强生面团的延伸性的戊聚糖的部分水解)，葡萄糖氧化酶(用于增强生面团强度)，脂酶(用于修饰存在于生面团或生面团构造的脂酶以便柔软生面团)，过氧化物酶(用于改良生面团稠度)，蛋白酶(用于明胶蛋白的弱化，特别是当利用硬的小麦面粉)，肽酶和/或淀粉酶，例如α-淀粉酶(用于提供酵母发酵糖)。
另外，或作为其它酶成分的替代，改良生面团和/或面包改良组合物可以包括常规使用的发粉，例如，一种或多种下面的成分：
奶粉(提供皮的颜色)，面筋(提高弱的面粉的气体滞留能力)，乳化剂(提高生面团的延伸性和得到的面包的一定程度的稠度)，颗粒脂肪(为了生面团柔软和面包稠度)，氧化剂(加入以便增强面筋结构，例如抗坏血酸，溴化钾，碘化钾或过硫酸铵)，氨基酸(例如，半胱氨酸)，糖，和盐(例如，氯化钠，乙酸钙，硫酸钠或硫酸钙作用是使生面团更加坚硬)，面粉或淀粉。
适当的乳化剂的例子是单或二甘油酯，甘油的二乙酰酒石酸单或二酯，脂肪酸的糖酯，脂肪酸的聚甘油酯，甘油单酯的乳酸酯，单酰甘油的乙酸酯，聚氧乙烯硬脂酸，磷脂和卵磷脂。
在本文中，术语“烘烤产品”打算包括柔软或脆特性的从生面团制备的任何产品。烘烤产品的例子，不管是白色，淡色或黑色类型，可以有利地通过本发明产生的是面包(特别是白色，全粉的或燕麦面包)，通常的形式是圆锥形或卷形，法式baguette型面包，pita面包，tacos，蛋糕，扁平面包，饼干，脆皮面包和诸如此类。
本发明的生面团可以是上面讨论的任何类型，并且可以是新鲜或冷冻的。
从上面的公开，可以明了本发明的生面团通常是发酵的生面团或待进行发酵的生面团。生面团可以各种方式发酵，如加入重碳酸钠和诸如此类，或通过加入曲(发酵生面团)，但优选地通过加入适当的酵母培养物如啤酒酵母的培养物(烘烤酵母)发酵生面团。可以利用任何市场可得的啤酒酵母菌株。
在本发明最后的实施方案中涉及了利用本发明的磷脂酶制备面食制品生面团，优选地从硬麦质面粉或相当质量的面粉制备。利用常规技术和如上所述利用同样剂量的磷脂酶可以制备生面团。例如上面公开，优选地磷脂酶是微生物来源。本发明涉及当用于制备面稂制品时，磷脂酶导致面筋结构的增强，所以降低了生面团的粘度和增强了生面团的强度。
本发明的酶的脂酶活性的应用
如本文工作实施例所示，本发明的磷脂酶可进一步显示脂酶活性。
因此本发明进一步涉及在脂酶的标准用途中利用这一脂酶活性，特别是用于去污和清洁组合物。本领域已经很好叙述了这样的去污和清洁组合物并且参考文献有WO96/34946；WO97/07202；和WO95/30011以便进一步叙述适当的去污和清洁组合物。
在下面的实施例中进一步详细叙述了本发明，这些实施例不打算以任何方式限制权利要求中的本发明的范围。
材料和方法
保藏的生物体：
尖孢镰孢DSM No.2672含有本发明的编码磷脂酶的DNA序列。含有质粒的大肠杆菌DSM 11299，在穿梭载体pYES2.0中含有编码本发明的磷脂酶的全长cDNA序列的质粒。
其它菌株
酵母菌株：利用的啤酒酵母菌株是W3124(MATa；ura3-52；leu2-3，112；his3-D200；pep4-1137；prc1∷HIS3；prb1∷LEU2；cir+)。
大肠杆菌菌株：DH10B(生命技术)
质粒：
曲霉属表达载体pHD414是质粒p775的衍生物(在欧洲专利238023中叙述)。在WO93/11249中进一步叙述了pHD414的构建。
pYES2.0(Invitrogen)
pA2PH10(参见实施例7)
常规的分子生物学方法
除非另有说明，否则利用分子生物学的标准方法进行DNA操作和转化(Sambrook等人(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港纽约；Ausubel，F.M.等人“分子生物学当前方案”JohnWiley和Sons，1995；Harwook，C.R.，和Cutting，S.M.“芽胞杆菌的分子生物学方法”John Wiley和Sons，1990)。
根据供应商的说明书使用用于DNA操作的酶。
用于DNA操作的酶
除非另有说明，否则用于DNA操作的所有酶例如限制性核酸内切酶，连接酶等等是从新英格兰生物实验室公司获得的。
基于NEFA-C测试的磷脂酶活性测试
底物：L-α-溶血磷脂酰胆碱(西格玛)
底物：大豆卵磷脂(西格玛#P3644)。用于测量磷脂酶A活性。
Nefa-C测试试剂盒是来自Wako化学品公司，德国。
缓冲液：20毫摩尔/升NaOAc pH4.5。
底物溶液：在1毫升milli Q水和1毫升缓冲液中的10毫克底物(对所有样品制备足够的底物溶液)
1.在150微升底物溶液中加入15微升酶
2.在40℃，温育10分钟。
3.将30微升转移到300微升试剂1(来自Nefa试剂盒)
4.在37℃温育10分钟。
5.加入600微升试剂2(来自Nefa-试剂盒)
6.在37℃温育10分钟。
7.在550纳米，根据Nefa试剂盒的说明测量最后反应产物的吸收值。
将每分钟酶反应生产1微摩尔脂肪酸需要的酶活性定义为1单位。
在酵母中表达克隆
如H.Dalboege等人的综合性叙述进行酵母中的表达克隆(H.Dalboege等人，分子遗传学(1994)243：253-260；WO93/11249；WO94/14953)，该文献引入本文作为参考。
根据上面提到的参考，进行总RNA的提取，cDNA合成，绿豆核酸酶处理，利用T4DNA聚合酶将末端平齐化，和文库的构建的所有每个步骤。
用于mRNA分离的尖孢镰孢DSM编号2672的发酵过程
在30℃，在YPD培养基中将尖孢镰孢DSM2672培养4天。在如下所述的平板测试中测试10微升上清液中的磷脂酶活性。
如H.Dalboege等人，分子遗传学(1994)243：253-260；WO93/11249；和WO94/14953中所述，从这一培养物中的营养菌丝分离mRNA。
阳性酵母克隆的鉴定(平板测试)：
如下所述进行阳性酵母克隆(即，含有编码磷脂酶活性的基因的克隆)的鉴定。
在含有2％葡萄糖的SC琼脂平板上涂布酵母转化体并且在30℃温育3天。在细胞的表面放置乙酸纤维素滤纸(OE67，Schleicher&Schuell)，然后转移到含有SC琼脂和2％半乳糖的平板上，细胞在滤纸的上面。在30℃温育3天后，将含有细胞的滤纸转移到底物平板上。鉴定阳性克隆为在菌落的底物平板中产生蓝绿圈的菌落。
以下面方式制作底物平板：在137.5毫升水中加入2.5克琼脂(BA-30INA琼脂，Funakoshi有限公司)，在微波炉中加热到沸腾。在冷却到约60℃，加入30毫升下面的混合物：62.5毫升0.4MTris-HCl缓冲液(pH7.5)和溶解于2％Triton X-100(v/v)的50毫升3％Lipoid E80(Lipoid GmbH，D-67065 Ludwigshafen，德国)和0.5毫升的2％亮绿水溶液。底物的浓度是重要的。如果浓度过高，它可以引起来自酵母细胞和/或来自具有磷脂酶副活性的丝状真菌脂酶的背景活性。
用于在曲霉中表达的cDNA基因的分离
在50毫升玻璃试管中的20毫升YPD肉汤中接种产生磷脂酶的酵母菌落。在30℃振摇试管2天。通过在3000rpm离心10分钟收集细胞。
根据WO94/14953分离DNA并且溶解于50毫升水。通过标准方法将DNA转化进入大肠杆菌。利用标准方法从大肠杆菌分离质粒DNA，并且进行限制性酶分析。利用适当的限制性酶切出cDNA插入片段并且连接到曲霉表达载体。
米曲霉或黑曲霉的转化
如WO95/02043，第16页，第21行-第17页第12行中所述可以制备原生质体，该文献引入本文作为参考。
将100微升原生质体悬浮液与10微升STC(1.2摩尔/升山梨醇，10毫摩尔/升Tris-HCl，pH＝7.5，10毫摩尔/升CaCl2)中的5-25微克适当的DNA混合。将原生质体与p3SR2(携带构巢曲霉amdS基因的质粒)混合。在室温下保留混合物25分钟。加入0.2毫升60％PEG4000(BDH29576)，10毫摩尔/升CaCl2，和10毫摩尔Tris-HCl，pH 7.5并且小心混合(两次)，最后加入同样的溶液0.85毫升并且小心混合。在室温下保留混合物25分钟，在2500g离心15分钟，并且在2毫升1.2摩尔/升的山梨醇中再悬浮沉淀。在再次沉降后，在最小平板上涂布原生质体(Cove，Biochem.Biophys.Acta113(1966)51-56)，最小平板中含有1.0摩尔/升蔗糖，pH7.0，10毫摩尔/升乙酰胺作为氮源和20毫摩尔/升CsCl以便抑制背景生长。在37℃温育4-7天后，挑出孢子和涂布单个菌落。重复这一过程，在二次分离后储藏单个菌落的孢子作为确定的转化体。
米曲霉或黑曲霉转化体的测试
在10毫升YPE(参见下面)中接种每个米曲霉转化体，并且繁殖。在30℃温育2-5天后，除去上清液。在底物平板中穿刺的洞中加载20微升上清液(见上文)。在1-24小时后，磷脂酶活性显色是洞周围的蓝绿圈。
补料分批的发酵
在含有麦芽糖糊精作为碳源，脲和酵母提取物作为氮源的培养基中进行批量进料发酵。在含有3.5％碳源和0.5％氮源的培养基中接种需要的米曲霉宿主细胞的振摇烧瓶培养物进行补料分批发酵。在pH7.0和34℃培养24小时后，开始连续供应其它碳源和氮源。维持碳源作为限制因子，并且保证氧过量存在。连续批量进料培养4小时。
SEQ ID NO：1中显示的DNA序列的分离
从保藏生物体大肠杆菌DSM11299，通过本领域已知方法提取质粒(Sambrook等人(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)可以获得编码本发明的磷脂酶的SEQ ID NO：1中显示的DNA序列的磷脂酶编码部分。
培养基
YPD：10克酵母提取物，20克蛋白胨，加水到900毫升
高压灭菌，加入100毫升20％葡萄糖(无菌过滤)。
YPM：10克酵母提取物，20克蛋白胨，加水到900毫升，高温灭菌，加入100毫升20％麦芽糖糊精(无菌过滤)。
10×基础盐：75克酵母氮碱，113克琥珀酸，68克NaOH，水加到1000毫升，无菌过滤。
SC-URA：100毫升10×基础盐，28毫升20％没有维生素的酪蛋白氨基酸，10毫升1％色氨酸，水加到900毫升，高温灭菌，加入3.6毫升5％苏氨酸和100毫升20％葡萄糖或20％半乳糖。
SC-琼脂：SC-URA，加入20克/升琼脂。
SC-变异琼脂：20克琼脂，20毫升10×基础盐，水加到900毫升，高压灭菌。
PEG4000(聚乙二醇，分子量＝4,000)(BDH，英格兰)。
实施例1
尖孢镰孢磷脂酶的发酵
将在琼脂斜面上的尖孢镰孢DSM2672的培养物转移到5个500毫升的振摇烧瓶中，每个含有100毫升Bouillon-3培养基，在30℃振摇1天(200rpm，振幅2.5厘米)。
Bouillon-3培养基的组成如下：
蛋白胨 6克/升
胰蛋白酶消化的酪蛋白 4克/升
酵母提取物 3克/升
肉提取物 1.5克/升
葡萄糖 1克/升
在121℃高压灭菌该培养基40分钟。
利用这些Bullion-3振摇烧瓶的培养肉汤作为种子培养物用于接种20个500毫升振摇烧瓶，每个含有200毫升PL-1培养基。
PL-1培养基的组成如下：
蛋白胨 10克/升
吐温-80 12克/升
MgSO4；7H2O 2克/升
CaCl2；2H2O 0.1克/升
在高压灭菌之前的pH 6.0
在121℃高压灭菌该培养基40分钟。
将含有0.5-2毫升Boullion-3培养肉汤的每个PL-1振摇烧瓶高温灭菌，并且在200rpm(振幅2.5厘米)，在30℃振摇5天。在收集时，合并来自振摇烧瓶的培养肉汤，总共3.9升，酶产量53LU/毫升。
实施例2
磷脂酶的纯化
步骤1)离心1升发酵上清液，并且丢弃得到的沉淀。然后，通过加入固体乙酸铵将上清液调节到0.8摩尔/升乙酸铵。
步骤2)从Toso Hass(Rohm和Hass公司，德国)购买疏水层析-Toyopearl丁基650C基质。利用基质填充50毫升的柱。利用50％乙醇并且随后利用水洗涤柱。然后，利用0.8摩尔/升乙酸铵平衡柱。利用0.8摩尔/升乙酸铵调节发酵上清液，然后加到柱上。然后，利用0.8摩尔/升乙酸铵洗涤未结合的物质直到除去所有UV吸收的物质(280纳米)。
然后，利用水，随后利用50％乙醇洗脱柱。
利用如上所述的NEFA试剂盒在pH4.5和40℃确定磷脂酶活性。合并在水和乙醇洗脱物中含有活性的组分。利用NEFA试剂盒测试在pH4.5测试活性。
然后合并含有磷脂酶活性的组分，并且利用截止分子量为10千道尔顿的Amicon超滤膜透析和浓缩。
步骤3-在DEAE快速流动层析上的阴性吸收。
DEAE FF是从Pharmacia购买的，利用该基质填充柱。
然后，如制造商的说明洗涤柱，利用pH7，25毫摩尔/升的Tris乙酸缓冲液平衡。
然后，将透析和浓缩的样品调节到pH7和传导性为2msi。并且加到阳离子交换DEAE FF柱上。
以流出物收集活性。该活性在pH7不结合阴离子交换物。
利用截止分子量为10千道尔顿的Amicon膜和25毫摩尔/升乙酸钠缓冲液pH6浓缩和透析来自含有活性的DEAE FF的流出物。
在Superdex75上凝胶过滤。
洗涤已经填充来自Pharmacia的柱Hiload Tm16/60的Superdex75，并且利用含有150毫摩尔/升NaCl的pH6d 25毫摩尔/升乙酸钠洗涤和平衡。
将来自在pH4.5和40℃的显示磷脂酶活性的阴离子交换物的2毫升浓缩的流出物加到Superdex柱上。
利用流速为1毫升/分钟通过凝胶过滤分离活性。
实施例3
从尖孢镰孢获得的纯化的磷脂酶的鉴定
在如实施例1所述发酵的尖孢镰孢磷脂酶上进行如下所述的鉴定，并且如实施例2所述纯化。
利用来自Novex Tm的4-20％SDS-PAGE预制平板确定磷脂酶的分子量。在如上所述的还原条件下确定蛋白质的分子量。
在还原条件下发现尖孢镰孢磷脂酶的分子量是29-30千道尔顿。
利用来自Pharmacia的两性电解质PAGE平板确定等电点。
发现尖孢镰孢的pI约为中性pH，优选地在范围5.8到6.8。
磷脂酶的热稳定性
通过DSC(差示扫描量热法)测试来自尖孢镰孢的磷脂酶的热稳定性。在恒定的，程序加热速度加热酶溶液后获得在示差热分析图(Cpvs.T)中的变性峰的峰值确定热变性温度，Td。
实验：
在实验中，利用来自Hart Scientific的DSC II(Utah，美国，1993)。
在pH10(50毫摩尔/升甘氨酸缓冲液)，pH7(50毫摩尔/升HEPES缓冲液+10毫摩尔/升EDTA)或pH4(50毫摩尔/升柠檬酸缓冲液)时利用50毫摩尔/升缓冲液作为酶的溶剂(约2毫克/毫升)。根据上面的实施例2纯化酶。
将750微升酶溶液转移到来自Hart Scietific的标准1毫升可封闭的hastelloy安瓿。将安瓿加载到比色计，并且冷却到5℃15分钟。在DSC扫描之前进行热平衡。以扫描速度约90K/小时从5℃到95℃进行DSC扫描。以约+/-2℃的精确度确定变性温度。
结果：
表1：作为pH的函数的变性峰值
pH Td(℃)
4 57℃
7 62℃
10 55℃
应该注意到这些实验是在缺乏可以明显影响酶稳定性的油基质时进行的。DSC的结果表明最大的稳定性接近中性pH。
假设热变性是不可逆的，在工业应用如油的脱胶中相关的执行温度(美国5,264,367)至少是低于上面表1列出的Td-温度约10℃。
氨基末端序列
利用Edman降解，利用如制造商所述进行的应用生物系统仪器(ABI 473A蛋白质序列仪，应用生物系统，美国)确定氨基酸末端分析。
N末端序列：
对于尖孢镰孢磷脂酶，N末端序列是
N-末端A-V-G-V-T-T-T-D-F-S-N-F-K-F-Y-I
N末端氨基酸“A”(丙氨酸)定位于SEQ ID NO：2的位置31。这表明本发明的成熟的磷脂酶在SEQ ID NO：2的位置31开始。
结果是，成熟的序列来自SEQ ID NO：2的31-346。
实施例4
磷脂酶A活性
利用大豆卵磷脂作为底物，如上所述在pH4.5，40℃可以确定磷脂酶A活性(基于NEFA测试的测试)。
在如上所述的条件下尖孢镰孢磷脂酶显示了明显的磷脂酶A的活性。
实施例5
针对L-α-溶血磷脂酰胆碱的活性
利用L-α-溶血磷脂酰胆碱作为底物，如上所述在pH4.5，在40℃确定磷脂酶的活性(NEFA测试基本测试)。
在如上所述的条件下尖孢镰孢磷脂酶显示了针对L-α-溶血磷脂胆碱的明显的活性。
实施例6
在单层建立(monolayer setup)中磷脂酶的活性
已经利用单层仪器(zero-order trough，KSV5000，KSV仪器，芬兰)评估针对磷脂DDPC(Di Dicanoyl(C10)磷脂酰胆碱)的各种酶活性。
实验
在完全纯化的缓冲液表面(10毫摩尔/升TRIS，pH8.0，25℃)上，涂布来自氯仿溶液的DDPC单层。在松弛单层后(蒸发氯仿)，将表面压力调节到15mN/m，对应的DDPC的平均分子面积约为632/分子。通过单层注射含有约60微克(微克)酶的缓冲液(参见上面)进入“zero-order trough”中的反应舱(面积1520平方毫米和30400立方毫米的体积的滚筒)的面下相中。通过压缩单层的可动屏障的速度表示酶活性以便维持恒定的表面压力因为不溶的底物分子水解成更加水溶性的反应产物。已经证实反应产物(葵酸和DDPC)的水溶性比DDPC高得多，可以从DDPC的平均分子面积(MMA)估计酶每分钟水解的DDPC分子的数目。
结果
表2.在单层建立中针对DDPC的酶的活性
酶 活性(纳摩尔/分钟)*)
西格玛P9279(来自蜂毒的PLA2，850U/毫克 1.9
来自尖孢镰孢的酶 2.7
Candida antarctica B成分脂酶 0
Candida antarctica A成分脂酶 0
重组的豚鼠胰脂酶(rGPL) 0.2
Lipolase(Novo Nordisk A/S) ＜0.1
*)从酶的存在诱导的每单位时间的单层面积的降低计算
在表2中“来自尖孢镰孢的酶”是本发明的磷脂酶，是如上所述的实施例2中纯化的。
结论
对于大多数酶没有检测到磷脂酶活性，除了从豚鼠脂酶获得的脂酶，显示较小的磷脂酶活性。
从尖孢镰孢获得的本发明的磷脂酶显示惊人地高的明显的磷脂酶活性。
结果是，在本发明中，术语“磷脂酶活性”，用于本文的本发明的磷脂酶的关系中，作为上面显示的“单层磷脂酶测试”中的活性确定至少为0.25纳摩尔/分钟，酶剂量：60微克；更优选地至少0.40纳摩尔/分钟，酶剂量：60微克；更优选地至少0.75纳摩尔/分钟，酶剂量：60微克；更优选地1.0纳摩尔/分钟，酶剂量：60微克；更优选地至少1.25纳摩尔/分钟，酶剂量：60微克；和甚至更优选地至少1.5纳摩尔/分钟，酶剂量60微克。
因此，定义术语“具有磷脂酶副活性的脂酶”为具有磷脂酶副活性的脂酶，琼脂实施例6中显示的“单层磷脂酶测试”中的磷脂酶副活性是小于上面提到的描述磷脂酶活性的数据。
根据本文的定义，具有磷脂酶副活性的脂酶的例子是上面的表2显示的豚鼠脂酶。所述的豚鼠脂酶在“单层磷脂酶测试”中具有磷脂酶副活性，该活性小于0.25纳摩尔/分钟，酶剂量：60微克。
实施例7
从尖孢镰孢DSM 2672克隆和表达磷脂酶
利用如上所述在酵母技术中的表达克隆进行克隆和表达。
从如上所述生长的尖孢镰孢DSM2672分离mRNA，包括搅拌保证足够的空气。在3-5天的生长后收集菌丝体，立即在液氮中冷冻，并且储藏在-80℃。如上所述，在大肠杆菌中构建来自含有约9×105个单个克隆的尖孢镰孢DSM2672的文库，载体背景为1％。将来自一些合并液的质粒DNA转化进入酵母，并且从每个合并液中获得含有250-400酵母菌落的50-100平板。
在底物平板上鉴定和分离磷脂酶阳性菌落(见上文)。直接从酵母菌落扩增cDNA插入，并且如材料和方法部分所述鉴定。SEQ ID NO：1显示了编码磷脂酶的cDNA的DNA序列，在SEQ ID NO：2中显示了对应的氨基酸序列。在从23到1060的SEQ ID NO：1 DNA核苷酸定义了磷脂酶编码区。在编码磷脂酶的成熟部分的SEQ ID NO：1中的DNA序列的部分包括位置113-1060，对应于SEQ ID NO：2中的氨基酸位置31-346。
从DSM11299中的质粒可获得cDNA。
从酵母菌落获得总DNA，通过如上所述的转化大肠杆菌恢复质粒DNA。为了在曲霉中表达磷脂酶，利用适当的限制酶消化DNA，在凝胶上进行大小分级分离，并且纯化对应于磷脂酶基因的片段。随后将基因连接到pHD414，利用适当的限制酶消化，得到质粒pA2PH10。
在大肠杆菌中扩增DNA后，如上所述将质粒转化进入米曲霉。
米曲霉转化体的测试
如上所述，测试每个转化体的活性。一些转化体具有明显高于米曲霉背景的磷脂酶活性。这证明在米曲霉有效地表达了磷脂酶。
实施例8
尖孢镰孢磷脂酶的重组表达
如上所述补料分批发酵含有曲霉表达载体pA2PH10的米曲霉转化体(参见实施例7)。如实施例2中所述进行重组生产的尖孢镰孢磷脂酶的纯化。
实施例9
从尖孢镰孢获得的重组表达和纯化的磷脂酶的鉴定
对重组表达和随后纯化的尖孢镰孢磷脂酶进行鉴定(参见实施例8)。
这些鉴定导致与实施例3中显示的特征结果准确的相关的本发明的重组尖孢镰孢磷脂酶，其中证明重组表达和纯化的酶是与实施例3中鉴定的非重组表达和纯化的磷脂酶相同的。
用于鉴定从尖孢镰孢获得的重组产生的磷脂酶的一般测试
磷脂酶测试：
当从卵磷脂释放游离的脂肪酸时，测量磷脂酶活性(PHLU)。加入50微升4％L-α-磷脂酰胆碱(来自Avanti，美国的植物卵磷脂)，4％Triton X-100，在50毫摩尔/升HEPES中的5毫摩尔/升CaCl2，pH7，将50微升酶溶液在50毫摩尔HEPES，pH7中稀释到适当的浓度。将样品在30℃温育10分钟，并且在离心之前在95℃5分钟终止反应(在7000rpm5分钟)。利用来自Wako化学GmbH的NEFA C试剂盒确定游离的脂肪酸；在250微升试剂A中加入25微升反应混合物，在37℃温育10分钟。然后加入500微升试剂B，再次在37℃温育样品10分钟。利用HP 8452A二极管排列分光光度计测量550纳米的吸收。至少以二份跑样品。包括了底物和无酶样品(预热酶样品(在95℃10分钟)+底物。利用脂肪酸标准作为油酸。1PHLU等于能够在这些条件下释放1微摩尔游离脂肪酸/分钟的酶量。
可替代地，在20毫摩尔/升柠檬酸缓冲液，pH5(Ca2+-游离)或20毫摩尔/升Britton-Robinson缓冲液中，在37℃进行测试(pH-图谱/温度图谱/稳定性)。
利用1-(S-葵酰基)-2-葵酰基-1-硫代-sn-甘油-3-磷酸胆碱(D3716分子探针)作为底物测量磷脂酶A1活性(PLA1)。在200微升比色杯中的190微升底物(100微升D3761(2毫克/毫升乙醇中)+50微升1％ Triton X-100+1.85毫升50毫摩尔/升HEPES，0.3毫摩尔/升DTNB，2毫摩尔/升CaCl2，pH7)中加入10微升酶，在室温下，在HP8452A二极管排列分光光度计上以时间的函数测量410纳米的吸光值。在线性范围以曲线的斜率计算活性。PLA1等于在这些条件下能够释放1微摩尔游离脂肪酸(硫代)/分钟的酶的量。
利用1-己葵酰-2-(1-芘葵酰)-sn-甘油-磷酸胆碱(H361分子探针)，在40℃测量磷脂酶A2活性(PLA2)。在2毫升比色杯中搅拌加入2毫升(50毫升1％ Triton X-100+25微升0.1％H361于乙醇中+10毫升50毫摩尔/升HEPES，pH7)中加入10微升酶，利用Perkin Elmer LS50仪器以时间的函数(1秒，间隔)测量376纳米(激发波长340纳米)处的芘荧光发射。在Triton X-100/磷脂胶束中，将磷脂的浓度调节到具有受激准分子形成(在480纳米发射)。在裂解后，在含有芘基团的2位置的脂肪酸释放加入水溶液导致单体发射的增加。确定PLA2为等条件的线性范围中曲线的斜率。
脂酶测试：
根据Novo Nordisk公开物AF95测量脂酶的活性(LU)。在30℃，pH7中水解三丁酸甘油酯后进行pH-状态滴定实验。1LU等于在标准条件下能够释放1微摩尔丁酸/分钟的酶量。
如下测量对橄榄油的活性(SLU)：在2.5毫升西格玛脂酶底物中加入12毫升5毫摩尔/升Tris-HCl，40毫摩尔/升NaCl，5毫摩尔/升CaCl2，pH9。在加入0.5毫升脂酶溶液(在缓冲液中稀释)和利用来自RadiometerA/S，Copenhagen丹麦得到的Titralab在30℃进行pH状态滴定测试之前将pH调节到pH9或调节到刚刚低于pH9。1SLU等于在pH9，30℃能够释放1微摩尔游离脂肪酸/分钟的酶量。
鉴定本发明的重组产生的尖孢镰孢磷脂酶
下面提到的用于鉴定酶的测试是上面刚刚叙述的测试方法。
酶：
具有SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列的尖孢镰孢的PL。
批号F-9700989，OD280 0.83(0.69毫克/毫升)，纯度＞95％(SDS-PAGE)。
如上所述重组表达和纯化酶。
LecitaseTM批号L546-F06(10368IU/毫升，约20毫克/毫升)
Lipolase(Novo Nordisk A/S)
研究Ca2+对尖孢镰孢脂酶/磷脂酶的磷脂酶活性的影响。不管是否在测试中含有EDTA或Ca2+或没有，没有观察到主要的差异(参见表3)，所以酶似乎是相对独立于Ca2+。表3依赖于EDTA和氯化钙-2％卵磷脂，2％ Triton X-100，20毫摩尔浓度柠檬酸盐，pH5，37℃时尖孢镰孢磷脂酶活性(pHLU)。
利用植物卵磷脂作为底物在Britton-Robinson缓冲液中研究pH值分布图(表4)。虽然该酶显示对于磷脂碱性pH分布图上最适pH为9或更高，低pH值时活性仍然足够高以在使油脱胶和提供用于烘烤的性能(参见下文的比活性比较)。表4 在37℃，2％卵磷脂，2％ Triton X-100，20mM BR时尖孢镰孢磷脂酶pH分布图
在pH5时获得了关于磷脂酶的温度分布图；在40℃以上温度时活性开始下降(表5)。这与通过将该酶预保温和然后测量残余的活性测定的温度稳定性合理地一致(表6)，其中酶在高达45℃温度，pH5时稳定。表5 2％卵磷脂，2％ 2％ Triton X-100，20mM BR时尖孢镰孢磷脂酶温度分布图
所有的数据以相对于作为标准值1的pH5，40℃时的活性的相对活性数据表示。表6 在20mM BR预保温30分钟，尖孢镰孢磷脂酶的温度稳定性
所有数据以残余活性数据表示，其中以5℃预保温后的活性作为标准值1。
有利地，以该酶的低稳定性显示一种最终产物作为加工助剂，因为在食用油的脱胶或烘烤产物的最终产物中不能期望有活性酶。
从本发明的尖孢镰孢获得的磷脂酶具有磷脂酶和脂酶活性。
因此，对该酶对各种不同的酯酶和磷脂酶底物的活性进行调查并且与商品磷脂酶LecitaseTM和商品脂酶Lipolase(Novo NordiskA/S)的活性进行比较。
尖孢镰孢磷脂酶/脂酶在pH7和9时对丁酸甘油酯和橄榄油具有活性(表7)。为了进行比较，Lipolase的比活性约为5000LU/毫克。但是，与Lipolase相反，尖孢镰孢脂酶显示具有相当大磷脂酶活性和也有硫酯酶活性的宽得多的特异性(参见上面实施例6的单层，显示Lipolase不具有可测量的磷脂酶活性)。
在pH7时本发明的尖孢镰孢磷脂酶/脂酶对卵磷脂的比活性比磷脂酶LecitaseTM(猪胰PLA2)的活性高得多(表7)。
与LecitaseTM相比，尖孢镰孢酶在pH7时具有高100倍的活性。在类似的条件下(pH7和30℃)对于尖孢镰孢酶的磷脂酶∶脂酶的比例约为0.225(1000LU/毫克/225pHLU/毫克)。表7 与LecitaseTM比较，尖孢镰孢脂酶/磷脂酶的活性
1PLU以类似于pHLU的方式测量，但是不同的是50毫摩尔浓度HEPES，pH7，30℃被20毫摩尔浓度的柠檬酸盐，pH5和37℃替代。
利用特异于磷脂酶A1的底物；测量在1-(S-癸酰基)-2-癸酰基-1-硫-sn-甘油-3-胆碱磷酸的1-位置的硫酯键的裂解研究尖孢镰孢脂酶/磷脂酶的特异性。
该酶明显地在磷脂的1-位置水解(表7)，而LecitaseTM(猪胰脏PLA2)如预期的对该底物没有显示活性。
本发明的尖孢镰孢磷脂酶C-末端的氨基酸序列
按照实施例3的描述，测定重组表达的成熟磷脂酶蛋白质的N-末端的氨基酸序列，并且证实该N-末端序列与对于非重组生产和纯化的酶测定的结果类似(参见实施例3)。
按照Christgau等人，生物化学杂志319，705-712，1996的描述，利用VG TofSpec质谱分析仪进行MALDI-TOF质谱分析。
背景技术
如从DNA序列推测的尖孢镰孢磷脂酶的N-末端的氨基酸序列预测与315个氨基酸残基的成熟磷脂酶蛋白质(如SEQ ID NO：的31到346位氨基酸)的已知的N-末端的氨基酸序列结合。该预测的蛋白质的理论质量是33256.8道尔顿。
利用MALDI-TOF质谱分析，我们以前已经测定了尖孢镰孢的真实的脂酶/磷脂酶的质量是28.2千道尔顿(数据未显示)，在SDS-PAGE上它显示的分子量为29-30千道尔顿(参见上文)。
由于真实的和重组的尖孢镰孢脂酶的N-末端氨基酸序列是相同的，可能由于C-末端的加工引起了预测的质量和试验质量之间看到的质量差异。
为了进行研究，我们已经分离了来自于在A.oryzae中表达的重组的尖孢镰孢脂酶的C-末端的肽并且从C-末端进行测序。
方案
可以将尖孢镰胞的真实的脂酶/磷脂酶的平均分子量28.2千道尔顿用于预测最合适的C-末端残基，它是丝氨酸303(SEQ ID NO：2)。
该推测是基于假设：该酶是非糖基化。存在于该序列的天冬酰胺163的单个潜在的N-糖基化位点可以没有被利用，因为脯氨酸残基存在于第164位。从未有报道在共有序列中存在脯氨酸作为第二位残基以便糖基化(天冬酰胺-Xaa-丝氨酸/苏氨酸)。另外，在质谱图上峰的形状不能显示糖基化作用。但是，该峰比通常包含于匀质蛋白质的峰较宽，这表明可能是大小异质性。由于该酶的N-末端被好地限定了，大小异质性最有可能是以异质性的C-末端的加工作为基础。
检查SEQ ID NO：2(参见下文)表明预测的C-末端紧密定位于该序列的8个Cys残基的最后。将放射性标记导入Cys残基使含有Cys残基的肽易于通过肽纯化变得痕量。将放射性标记与利用在Asp残基之前裂解Asp-N蛋白酶的蛋白质降解结合使用导致产生带标记的C-末端肽。另外，三个内部肽被标记。对所有的标记肽进行测序应该显示该酶的C-末端。
↑331 YVQMDKEYVK NNQARS 346
SEQ ID NO：2：尖孢镰胞脂酶/磷脂酶的预测的氨基酸序列
该序列是从DNA序列推导的并且对于真实的和重组酶都在试验测定的N-末端开始的。用
试验结果
酶是来自于尖孢镰胞PL，具有显示于SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
批号F-9700989，OD2800.83(0.63毫克/毫升)，纯度＞95％(SDS-PAGE)。
该酶是重组表达的并且如上所述进行纯化。
将酶变性并且在硫醇基与I[1-14C]CH2CONH2反应之前二硫键被还原。
将半胱氨酸残基放射性标记之后，利用Asp-N蛋白酶降解该脂酶。
利用反相HPLC将产生的肽分级分离。将收集的馏份进行MALDI-TOF质谱分析并且进行闪烁计数。选择含有显著量的放射性活性的馏份利用活性HPLC进行纯化。
将再纯化的馏份进行闪烁计数并且随后对含有放射性活性的馏份进行测序。
下面给出了结果的概述。由于给出许多序列，该示意图似乎无秩序。但是，该示意图含有从放射性馏份获得的所有序列数据，因此它代表了计算结果的基础。应该注意到通过测序覆盖了所有的Cys-残基；大多数测序过程在一次以上。值得注意到的另一件事情是所看到的异常裂解，导致产生大量的小肽放射性标记的。
NG CPT
NNG CPTVQ
CSN
CSNNG CP
CSNNG CPTV
CNSEAAA GSKI31 AVGVTTTDFS NFKFYIQHGA AAYCNSEAAA GSKITCSNNG CPTVQGNGAT 80
DCS
DCS81 IVTSFVGSKT GIGGYVATDS ARKEIVVSFR GSINIRNWLT NLDFGQEDCS 130
LVSGC
LVSGCGVHSG FQRAW131 LVSGCGVHSG FQRAWNEISS QATAAVASAR KANPSFNVIS TGHSLGGAVA 180181 VLAAANLRVG GTPVDIYTYG SPRVGNAQLS AFVSNQAGGE YRVTHADDPV 230
DVKVCEG
DVKVCEGA ANLGCNGGTL
DVKVCEGA ANLGCNGGTL231 PRLPPLIFGY RHTTPEFWLS GGGGDKVDYT ISDVKVCEGA ANLGCNGGTL 280
DACNAG GFS
GL TDACNAG GF281 GLDIAAHLHY FQATDACNAG GFSWRRYRSA ESVDKRATMT DAELEKKLNS 330
↑331 YVQMDKEYVK NNQARS 346
通过对来自于重组的尖孢镰胞酶的放射性标记的肽进行测序获得的氨基酸序列。将序列与从DNA序列推测的预测的氨基酸序列进行序列比较。用
试验结果
从对所有放射性比较的肽进行测序可以清楚地看到在从尖孢镰胞表达脂酶期间将DNA编码的氨基酸序列的C-末端部分进行加工。根据MALDI-TOF质谱分析获得的结果，该肽序列暗示丝氨酸303最有可能是成熟蛋白质的C-末端的残基。
但是基于这些数据，但不能拒绝考虑出现了差异的C-末端加工，导致异质性的C-末端；例如一个肽表示也发现苯丙氨酸272作为C-末端残基。
实施例10
食用油的酶促脱胶测试的总的描述
用于实施酶促脱胶的设备
该设备由装备了一个钢盖，一个螺旋桨(600rpm)，挡板，一个温度传感器，顶部的一个输入管，顶部的一个回流冷凝器(4℃)，底部的一个输出管的1升套层钢反应罐组成。将反应罐套连接到恒温浴。借助于硅管将输出管连接到silvarson排齐的混合器头，所述混合器头装备了“方形的孔眼高煎切筛”，所述筛由silvetson L4RT高煎切实验室混合器(8500rpm，流速约为1.1l/分钟)驱动。混合器的头部装备了冷却线圈(5-10℃)和一个输出管，该输出管借助于硅管与反应罐的输入管连接。在紧接混合器头部后将温度传感器插入到硅管。反应罐/混合器头部系统到大气的唯一的连接是通过回流冷凝器。
实施酶促脱胶的总的程序
开启所有的冷却和恒温设备。然后将0.6升(约560克)的油加载到反应罐，反应罐保持在特异性的实验所需的温度。打开实验室用混合器，从而油开始从反应罐到混合器头部和反应罐北部的循环。允许该系统平衡约10分钟，在此期间，温度精确地转动。在27克MilliQ水中加入0.6克(2.86mmol)一水柠檬酸开始预处理阶段(加入的水/油等于4.8％w/w；水相中(柠檬酸)＝106mM，在水/油乳液中＝4.6mM)，设置t＝0，在t＝30分钟时，加入合适量的4M氢氧化钠溶液。
0.0当量4M氢氧化钠 →pH3.7
1.0当量4M氢氧化钠(0.714毫升) →pH4.5
1.5当量4M氢氧化钠(1.07毫升)→pH5.0
2.0当量4M氢氧化钠(1.43毫升)→pH5.5
2.5当量4M氢氧化钠(1.79毫升)→pH6.2
3.0当量4M氢氧化钠(2.14毫升)→pH8.0
在t＝35分钟时，获取样品进行P-分析和pH测定。紧接在该步骤之后，加入所需量的酶溶液(预处理期间的结束时)。在t＝1，2，3.5，5，6小时获取进行P-分析和pH测定的样品，然后终止该反应。
倒空反应罐/混合器系统并且用2×500毫升10％Deconex/DT水溶液清洗，随后最少的3×500毫升的DI水清洗。表8提供了反应期间各种添加剂和获取的样品。
表8 酶促脱胶的时间表
磷分析
用于P-分析的样品：
在玻璃离心管中加入10毫升的油包水乳液。将该乳液在沸水浴中加热30分钟。以5000rpm离心10分钟。将约8毫升的上部(油)相转移到12毫升的聚苯乙烯管并且将它保持(沉积)12-24小时。之后从上部澄清相获取约1-2克沉淀物进行P-分析。
根据在“用于油，脂肪和衍生物分析的标准方法，第7版(1987)”的2.421程序进行P-分析：
称取100毫克的氧化镁(leicht，Merck#5862)置于瓷盘并且用气体炉子加热。加入1-2克的油并且用气体炉子点燃一获得黑色的，硬的块。在Vecstar炉子中在850℃加热2小时获得白色灰。将白色灰溶解于5毫升的6M硝酸并且加入20毫升的试剂混合物。保留20分钟。在460nm测量吸收值(利用空白(5毫升硝酸+20毫升试剂混合物)用于校正0)。利用标准曲线计算。
pH测定
取2毫升的水溶于油乳液并且与2毫升的MilliQ水混合。在相分离后，用吸管吸取顶部油层。用pH电极Orion测量含水相的pH值。采用下面的通式将测量值转化为“真正”pH值
pH真正＝pH测量-0.38
通过将0.6克的一水柠檬酸溶解于27克的去离子水获得校正曲线；采用pH电极Orion测量该溶液的pH值(pH真正)。将100微升与2毫升的MilliQ水混合，采用pH电极Orion测量该溶液的pH值(pH测量)。通过将氢氧化钠溶液加入逐渐改变柠檬酸溶液的pH，并且对每次调整，如上所述进行稀释和pH测量。
实施例11
LecitaseTM的最适脱胶条件
涉及食用油脱胶的所有的试验按照实施例10的描述进行。
油：
水脱胶的菜籽油(Colzro)来自于丹麦的Aarhus Oliefabrik。
批号C00730/B01200，9千克，P-含量为186ppm(0.74％磷脂)。
油不是商品产物，但是可直接从磨坊的生产线获取。
酶：
10升LecitaseTM
批号L646-F02(10190U/毫升)，估测的浓度20毫克/毫升。
在表9中给出了用LecitaseTM进行的一系列参数最适化试验的特异性条件。标准条件是：酶剂量535U/千克油(1.1毫克/千克油)，60℃，2.0当量的氢氧化钠(pH5.5)。酶量已从268-1070u/kg油变化，温度已经从40-70℃变化，和加入的氢氧化钠已经从1.0-3.0当量变化，这对应于各个pH水平，如表9显示的。
表9 LecitaseTM最适化的特异性条件
在表10中获得了所提供的单个的最适化研究。
表10的结果显示，
i)从剂量/应答调查可以看到最适的酶剂量(在60℃和2.0当量氢氧化钠)是约535U/千克油。半剂量将脱胶时间从约3.5增加到6小时，双倍剂量对脱胶性能没有引起任何变化。已经插入酶空白结果进行比较；
ii)最适氢氧化钠的加入是约2.0当量(pH在约5.5)，在1.0当量(pH在约4.5)和3.0当量(pH在约8)有差性能；
iii)最适温度是约60℃，因为70℃没有引起P-水平总的下降，50℃将脱胶时间从约3.5增加到6小时，和40℃获得差性能。
表10：LecitaseTM脱胶条件的最适化的结果
实施例12
根据本发明的尖孢镰胞磷脂酶的最适的脱胶条件
涉及食用油酶促脱胶的所有的试验按照实施例10的描述进行。
油：
水脱胶的菜籽油(Colzro)来自于丹麦的Aarhus Oliefabrik。
批号C00730/B01208，P-含量为约200ppm。
批号C00730/B01209，P-含量为约200ppm。
批号C00730/B01429，P-含量为227ppm。
批号C00730/B01430，P-含量为252ppm。
油不是商品产物，但是可直接从磨坊的生产线获取。
酶：
从尖孢镰胞获得的具有显示于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的PL。
批号F-9700123，OD280 1.48，纯度约58％，估测的浓度0.9毫克/毫升。
如上所述进行酶的重组表达和纯化。
在表11中给出了用来自于尖孢镰胞的PL进行的一系列参数最适化试验的特异性条件。标准条件是：酶剂量1.6毫克/千克油，40℃，1.5当量的氢氧化钠(pH5.0)。酶剂量已经从0.2-1.6毫克/千克油变化，温度已经从30-50℃变化，和加入的氢氧化钠已经从1.0-2.5当量变化，这对应于各个pH水平，如表11显示的。
表11来自尖孢镰孢的PL的最优化的具体条件
总之，在下面的表12中的结果显示，
i)从剂量/应答测试可以看到最适的酶剂量(在40℃和1.5当量氢氧化钠)是约0.8毫克/千克油；
ii)最适氢氧化钠的加入是约1.5当量(pH在约5.0)，而在1.0当量(pH在约4.5)没有性能，和在2.0当量(pH约5.5)和在2.5当量(pH约6.2)有有限的性能，和；
iii)最适温度是约45℃，而50℃获得有限的性能。
表12：尖孢镰胞脱胶条件的最适化的结果
实施例13
在酶促脱胶过程期间标准的pH偏差的描述
下面的表13显示在如实施例10描述的酶促脱胶过程期间pH偏差的一般例子。
用LecitaseTM进行试验。进一步详细情况参见实施例11。
表13：从t＝35分钟到6小时的pH值
如果在本文公开的酶促脱胶试验的实施例没有进一步提到，那么在所述试验中标准的pH偏差显示于上文的表13。
实施例14LecitaseTM和本发明的尖孢镰胞的磷脂酶的酶促脱胶性能的比较
在附图2中，显示了在其各自的最适条件下PL’s的结果，如在上面的实施例11和12中测定的。
显示于附图2的试验条件：
LecitaseTM：60℃，pH5.5(2.0当量的氢氧化钠)，和1毫克的酶/千克油(约535U)(试验#9)。
尖孢镰胞PL：40℃，pH5.0(1.5当量氢氧化钠)，和0.8毫克酶/千克油(试验#33)。
尖孢镰胞PL：45℃，pH5.0(1.5当量氢氧化钠)，和1.6毫克酶/千克油(试验#64)。
显然，与LecitaseTM相比，来自于尖孢镰胞的PL获得了非常快的脱胶效果。
根据本发明，在将酶与油接触25分钟之后来自于镰胞的PL获得了几乎完全的脱胶作用。
实施例15
存在于不同类型的食用油的非可水解的磷脂的量的测定
油：
来自于丹麦的Aarhus Oliefabrik(AOM)的粗制菜籽油，批号C00745/B01146，P-含量609ppm。该批号含有固体残留物。
来自于Scanola(丹麦)的粗制菜籽油，批号C00745/B01593，P-含量315ppm。
经过滤的粗制菜籽油，过滤的批号C00745/B01146，P-含量231ppm。
该油的批号是经过100微米Johnson滤膜过滤的上面所述的C00745/B01146(609ppm)。
来自于丹麦的Aarhus Oliefabrik(AOM)的粗制菜籽油，批号C00745/B01700，P-含量459ppm。
来自于德国Lurgi的菜籽油，批号C00932/B01381，P-含量148ppm。
来自于丹麦的Aarhus Oliefabrik(AOM)的粗制油菜子油，批号C00745/B01145，P-含量593ppm。
通过用包括溶解于水的一水柠檬酸的溶液预处理油进行如上显示的存在于食用油的不同类型的非可水解的磷脂的量的测定，如在上面实施例10描述的。
简单地说，预处理过程包括，
i)在60℃，通过加入包括溶解于水的一水柠檬酸的溶液预处理食用油(加入的水比油等于4.8％w/w；(柠檬酸)在水相＝106mM，在水/油乳液＝4.6mM)30分钟；
ii)将10毫升的预处理的油包水乳液转移到试管；
iii)在沸水浴中加热该乳液30分钟；
iv)以5000rpm离心10分钟，
v)将约8毫升的上层(油)相转移到新的试管并且将其放置24小时；在沉淀之后，从上层澄清相取2克用于测定食用油中的非可水解的磷的含量(ppm)。如上面实施例10描述测定ppm值。
在该过程之后，如上显示的存在于不同类型的食用油中的非可水解的磷脂的量是，
来自于AOM的粗制菜籽油#1146含有固体颗粒状物质，这部分是由于高P-水平(609ppm)引起的；经过100微米的Johnson筛过滤获得了磷含量为231ppm的澄清油。
对粗制油和过滤的油进行预处理获得了140ppm的P-水平，这是存在于该油的非可水解的磷脂的测量值；
通过预处理来自于粗制菜籽油的磷脂的含量是从315ppm降低到约30ppm；
通过预处理过程来自于Lurgi的菜籽油(可能是粗制油和完全精炼的油的任意混合物)的磷脂含量降低到60ppm；
预处理的来自于AOM的粗制菜籽油#1710的P-含量从459降低到200-250ppm；
对来自于AOM的粗制黄豆油#1145预处理的P-含量从593降低到10ppm。该黄豆油构成了通过单独的水脱胶/柠檬酸处理而脱胶的油的例子。在预处理之后向该粗制豆油中加入酶没有进一步降低P-含量。
这些资料显示粗制菜籽油的磷脂的组成(水合与非水合的磷脂的比例)每批与每批之间有很大的不同，结果是，水脱胶的油菜子油的剩余的磷脂的水平在较宽的范围内(30ppm(Scanola)到200-500ppm(AOM))变化。
为了进行酶促脱胶，最适的酶剂量依赖于脱胶或预处理之后存在的非水合的磷脂的量。
此外，存在于油的非水合的磷脂的年越高，该酶促脱胶方法越有效。
在下面的实施例16中也进行描述，其中本发明显示存在菜籽油#1146的酶促脱胶，所述的油具有约140ppm的非水合的磷脂的水平。
实施例16
粗制菜籽食用油(I)的脱胶
根据上面的实施例10描述的“用于实施酶促脱胶的一般的程序”进行试验A和B。
油：
来自于丹麦的Arhus Oliefabrik(AOM)的粗制菜籽油，批号C00745/B01146，P-含量609ppm。该批号含有固体残留物。
酶：
LecitaseTM 10L
批号L646-F02(10190U/毫升)，估测的浓度20毫克/毫升。
从尖孢镰胞获得的具有显示于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的PL。
批号F-9700123，OD280 1.48，纯度约58％，估测的浓度0.9毫克/毫升。
如上所述进行酶的重组表达和纯化。
试验A(参照)
将0.6升(580克)的粗制菜籽油上样到该设备并且加热到60℃。在t＝30分钟时，加入1.43毫升(5.7mmoles)的4M氢氧化钠溶液，产生pH约5.6。在t＝35分钟时，加入30微升(300单位)的LecitaseTM10L(从Novo Nordisk A/S获得)。在离心之后测定的油相中的磷的含量以及水相的pH值显示于表14。
表14 用LecitaseTM对粗制的菜籽油脱胶的结果
试验B
将0.6升(581克)的粗制菜ob油上样到该设备并且加热到40℃。在t＝30分钟时，加入1.07毫升(4.3mmoles)的4M氢氧化钠溶液，产生pH约5.4。在t＝35分钟时，加入来自于尖孢镰胞的磷脂酶的纯化的溶液(实施例2)1毫升(0.9毫克)。在离心之后测定的油相中的磷的含量以及水相的pH值显示于表15。
表15用来自于尖孢镰胞的磷脂酶对粗制的菜籽油脱胶的结果
实施例17
粗制菜籽食用油(II)的脱胶
根据上面的实施例10描述的“用于实施酶促脱胶的一般的程序”进行试验A和B。
油：
来自于丹麦的Arhus Oliefabrik(AOM)的粗制菜籽油，批号C00745/B01710，P-含量459ppm。
酶：
LecitaseTM 10L
批号L646-F02(10190U/毫升)，估测的浓度20毫克/毫升。
从尖孢镰胞获得的具有显示于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的PL。
批号F-9700476，OD280 0.8，纯度约58％，估测的浓度0.45毫克/毫升。
如上所述进行酶的重组表达和纯化。
试验A(参照)
将0.6升(580克)的粗制油菜子油上样到该设备并且加热到60℃。在t＝30分钟时，加入1.43毫升(5.7mmoles)的4M氢氧化钠溶液，产生pH约5.6。在t＝35分钟时，加入合适量(例如50微升(约500单位)的1毫克酶/千克油)的LecitaseTM 10L(从Novo NordiskA/S获得)。在离心之后测定的油相中的磷的含量以及水相的pH值显示于表16。
表16 用Lecitase对粗制的菜籽油脱胶的结果
试验B
将0.6升(581克)的粗制油菜子油上样到该设备并且加热到40℃。在t＝30分钟时，加入1.07毫升(4.3mmoles)的4M氢氧化钠溶液，产生pH约5.0。在t＝35分钟时，加入来自于尖孢镰胞的磷脂酶的纯化的溶液(实施例2)的合适量(即1.6毫克酶/千克油，和3.2毫克酶/千克油)。在离心之后测定的油相中的磷的含量显示于表17。
表17用来自于尖孢镰胞的磷脂酶对粗制的菜籽油脱胶的结果
结果概述如下，Lecitase，60℃，pH5.5
酶剂量在1.0到3.0毫克/千克油的范围内变化。结果在上面的表16中给出。在1.0毫克/千克油的酶剂量时，脱胶慢并且在6小时获得约20ppm。在高酶剂量时，用3.0毫克酶/千克油在约3.5小时内将脱胶性能改善到10ppm磷含量。
推测如果使用较高的酶剂量脱胶性能将进一步获得改善。尖孢镰胞PL，45℃，pH5.0
测试1.6和3.2毫克/千克油的酶剂量，发现其性能同样的好(上面表17)。用1.6毫克/千克油-或可能较低-观察到优秀的脱胶作用，在约2小时获得9ppm的磷。可以预见可以利用更低量的尖孢镰胞磷脂酶(例如0.9毫克/千克油)并且仍然具有好的脱胶性能。
实施例18
利用从大刀镰胞获得磷脂酶制剂对水脱胶的食用油进行脱胶
根据上面的实施例10描述的“用于实施酶促脱胶的一般的程序”进行试验A和B。
油：
来自于丹麦的Arhus Oliefabrik(AOM)的粗制菜籽油，批号C00745/B01700，P-含量231ppm。
酶：
来自于大刀镰胞的发酵液
如下所述培养，离心大刀镰胞菌株并且纯化上清液。
在含有100毫升的下面的组分的500毫升的摇瓶中产生大刀镰胞
CBS513.94菌株(保藏于1994年10月25日)的种子培养物：
玉米浸出液(无水) 12克/升
葡萄糖 24克/升
向每个瓶中加入0.5克碳酸钙和0.5毫升的油。在高压蒸汽灭菌之前将pH调节到5.5。
在26℃和250rpm培养3天之后，将各5毫升的种子培养液接种到含有100毫升的下面培养基的摇瓶中：
蛋白胨，Difco 0118 6克/升
Pepticase，Sheffield产 4克/升
酵母提取物，Difco 0127 3克/升
肉提取物，Difco 0126 1.5克/升
葡萄糖，Roquette 101-0441 1克/升
橄榄油，Sigma 10克/升在高压蒸汽灭菌之前将pH调节到7.3-7.4。
在26℃和250rpm培养9天，离心和过滤(0.45微米)该培养液，收集上清液并且用于下面显示的脱胶试验。
估测的活性是200PHLU/毫升。
试验：利用从尖孢镰胞获得的磷脂酶制剂对水脱胶的油进行酶促脱胶
将0.6升(581克)的粗制菜籽油上样到该设备并且加热到40℃。在t＝30分钟时，加入1.43毫升(5.7mmoles)的4M氢氧化钠溶液，产生pH约5.5。在t＝35分钟时，加入合适量的来自于大刀镰胞的磷脂酶的纯化的溶液(即1070PHLU/千克油)。在离心之后测定的油相中的磷的含量，显示于表18。
表18 用来自于大刀镰胞的磷脂酶对粗制的菜籽油脱胶的结果
实施例19
利用Degomma VOD对粗制油进行酶促脱胶
油：
粗制菜ob油，批号C00745/B01700，P-含量459ppm。
酶：
商品磷脂酶Degomma VOD(Rohm；德国)，估测的浓度10毫克/毫升。
将0.6升(581克)的粗制菜ob油上样到该设备并且加热到40℃。在t＝30分钟时，加入0.714毫升(2.86mmoles)的4M氢氧化钠溶液，产生pH约4.5。在t＝35分钟时，加入合适量的Degomma VOD磷脂酶的纯化的溶液(即3.6毫克/千克油，或7.1毫克/千克油)。在离心之后测定的油相中的磷的含量显示于表19。
表19
该实施例说明Degomma VOD能够对食用油脱胶。但是，为了获得满意的所述油的脱胶，与本发明的镰胞磷脂酶相比需要相对高剂量的Degomma VOD。参见例如实施例16和17进行比较。
实施例20
利用来自于尖孢镰胞的磷脂酶作为面包改良剂
材料和方法
面包的制备
按照下面的基本配方制备欧洲直式生面团白面包和小白面包(roll)：
基本配方
面粉(Meneba BBZ) 100％(2000克)
水 61％
酵母 4％
盐 1.5％
糖 1.5％
抗坏血酸 40ppm
烘烤程序
混合(螺旋式混合器)，625RPM 3分钟
混合(螺旋式混合器)，1250rpm 3.5分钟
生面团的评价 7分钟
发酵(室温) 15分钟
压片/成形 3分钟
在室温下松驰 5分钟
摺叠 2分钟
在室温下松驰 5分钟
压片/成形/放入模内(panning) 2分钟
醒发成形(32℃，82％RH) 小白面包： 45分钟
装模烤的面包(Panned bread)： 55分钟
烘烤(230分钟) 小白面包： 22分钟
装模烤的面包： 35分钟
生面团和烘烤的产品的评价
生面团和烘烤的产品的特性如下所述测定：
比容指数：借助于传统的菜籽替换方法可以测量一个面包或小白面包的体积。将比容计算为每克面包毫升体积。对照(没有酶)的比容定义为100。相对比容指数计算为：
面包的比容
比容指数＝-----------------------------------×100
对照面包的比容
根据下面评分人工评价生面团的粘度：小白面包站立性(Roll standing) 非常平 1
平 2
正常 3
好/圆 4
非常好 5
太圆 6结果表20
该结果显示在不含有卵磷脂的配方中尖孢镰孢磷脂酶对小白面包和装模烤的面包有明显的体积增加作用。如果配方包括卵磷脂，可以获得更好的体积效果，虽然卵磷脂对本身体积不起作用。用Statgraphics Plus，release3.0进行的统计学分析(ANOVA，α＝0.05)显示磷脂酶和卵磷脂之间显著的阳性协同作用。
在有和没有卵磷脂的配方中，用尖孢镰孢磷脂酶获得了小白面包形状的显著改善(小白面包站立性)。在该实施例中，通过将卵磷脂和磷脂酶(1500LU/千克面粉)结合获得了最好的小白面包站立性。
实施例21
将从尖孢镰孢获得的磷脂酶用于面包中作为抗老化剂
材料和方法
面包的制备
按照下列基础配方制备欧洲直式生面团白面包和小白面包：
基础配方
面粉(Meneba BBZ) 100％(2000克)
水 61％
酵母 5％
盐 1.5％
糖 1.5％
抗坏血酸 40ppm
烘烤程序
混合(螺旋混合器)，625RPM 3分钟
混合(螺旋混合器)，1250RPM 3.5分钟
生面团的评估 7分钟
发酵(室温) 15分钟
压片/成形 3分钟
在室温下松弛 5分钟
摺叠 2分钟
在室温下松弛 5分钟
压片/成形/放入模内 2分钟
醒发成形(32℃，82％RH) 55分钟
烘烤(230℃) 35分钟
在该实施例，在有盖的模内中烤制面包，以便避免在结构分析之前比容的不同。在冷却之后，将面包在室温下保存，包装到塑料袋。
烘烤的产物的评估
根据AACC方法74-09可以进行不新鲜程度和结构的评估。根据下面的程序，在烘烤之后0，1，3和7天对面包屑的柔软性进行评估作为面包不新鲜程度的指标：
在结构分析仪(TA TX-2)中以不变的速度压缩一片面包，以克测量压缩使用的力。测量面包屑的坚固性以25％压缩力表示。由于面包变成不新鲜，面包屑的坚固性增加。
结果
坚固性测量与储藏天数的函数关系的结果显示于表2。以1克/千克面粉的浓度加入Lecimulthin，以500U/千克面粉的剂量加入尖孢镰孢磷脂酶。表中的每个数据是6次测量的平均值(2个面包，各测量3次)。
表21
如表21显示的，在储藏达3天时，用磷脂酶处理的面包稍微比对照松软。与卵磷脂结合时，在整个储藏期间，可以获得显著的抗老化作用(仅用卵磷脂或磷脂酶不能获得)。
序列表
SEQ ID NO：1显示了本发明的克隆的DNA序列，包括编码显示磷脂酶活性的酶的DNA序列。
(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：1170个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(vi)原始来源：
(A)生物体：尖孢镰孢
(B)菌株：DSM 2672
(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：23..1063
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：TTGGAGAATA TTCCTTGTCA CG ATG CTT CTT CTA CCA CTC CTC TCG GCC ATC 52
Met Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Ala Ile
1 5 10ACC CTC GCG GTA GCC AGT CCT GTA GCT CTC GAC GAC TAC GTC AAC TCT 100Thr Leu Ala Val Ala Ser Pro Val Ala Leu Asp Asp Tyr Val Asn Ser
15 20 25CTT GAG GAG CGA GCT GTT GGT GTC ACT ACA ACC GAC TTC AGC AAC TTC 148Leu Glu Glu Arg Ala Val Gly Val Thr Thr Thr Asp Phe Ser Asn Phe
30 35 40AAG TTC TAC ATC CAA CAC GGC GCC GCA GCT TAC TGC AAC TCT GAA GCC 196Lys Phe Tyr Ile Gln His Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Glu Ala
45 50 55GCA GCT GGT TCC AAG ATC ACC TGC TCC AAC AAT GGC TGT CCA ACC GTT 244Ala Ala Gly Ser Lys Ile Thr Cys Ser Asn Asn Gly Cys Pro Thr Val
60 65 70CAG GGC AAC GGA GCG ACC ATC GTG ACA TCT TTC GTT GGC TCC AAG ACA 292Gln Gly Asn Gly Ala Thr Ile Val Thr Ser Phe Val Gly Ser Lys Thr75 80 85 90GGT ATC GGT GGC TAC GTC GCG ACA GAC TCT GCC CGA AAG GAA ATC GTC 340Gly Ile Gly Gly Tyr Val Ala Thr Asp Ser Ala Arg Lys Glu Ile Val
95 100 105GTC TCG TTC CGC GGA AGC ATC AAT ATT CGA AAC TGG CTT ACC AAC CTC 388Val Ser Phe Arg Gly Ser Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu
110 115 120GAC TTC GGC CAG GAA GAC TGC AGT CTC GTC TCT GGA TGC GGT GTG CAC 436Asp Phe Gly Gln Glu Asp Cys Ser Leu Val Ser Gly Cys Gly Val His
125 130 135TCT GGC TTC CAG CGA GCC TGG AAT GAG ATC TCG TCT CAA GCA ACC GCT 484Ser Gly Phe Gln Arg Ala Trp Asn Glu Ile Ser Ser Gln Ala Thr Ala
140 145 150GCT GTT GCC TCC GCC CGC AAG GCG AAC CCT TCT TTC AAC GTC ATT TCT 532Ala Val Ala Ser Ala Arg Lys Ala Asn Pro Ser Phe Asn Val Ile Ser155 160 165 170ACA GGC CAC TCC CTT GGA GGT GCC GTG GCC GTT CTT GCT GCC GCA AAC 580Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Val Leu Ala Ala Ala Asn
175 180 185TTG AGA GTC GGT GGA ACA CCC GTC GAT ATT TAC ACC TAC GGC TCT CCC 628Leu Arg Val Gly Gly Thr Pro Val Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro
190 195 200CGT GTC GGA AAC GCG CAG CTC TCA GCC TTC GTC TCA AAC CAG GCT GGT 676Arg Val Gly Asn Ala Gln Leu Ser Ala Phe Val Ser Asn Gln Ala Gly
205 210 215GGA GAG TAC CGC GTT ACA CAC GCT GAT GAC CCT GTC CCC CGT CTC CCT 724Gly Glu Tyr Arg Val Thr His Ala Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro
220 225 230CCT CTG ATC TTC GGA TAC AGG CAC ACA ACT CCT GAG TTC TGG CTG TCC 772Pro Leu Ile Phe Gly Tyr Arg His Thr Thr Pro Glu Phe Trp Leu Ser235 240 245 250GGC GGT GGA GGC GAC AAG GTT GAC TAC ACC ATC AGC GAT GTC AAG GTC 820Gly Gly Gly Gly Asp Lys Val Asp Tyr Thr Ile Ser Asp Val Lys Val
255 260 265TGT GAG GGT GCT GCC AAC CTT GGA TGC AAC GGT GGA ACT CTT GGT TTG 868Cys Glu Gly Ala Ala Asn Leu Gly Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu
270 275 280GAT ATT GCT GCT CAT CTG CAT TAC TTC CAG GCG ACT GAC GCC TGT AAC 916Asp Ile Ala Ala His Leu His Tyr Phe Gln Ala Thr Asp Ala Cys Asn
285 290 295GCT GGT GGC TTC TCT TGG CGA CGA TAC AGA AGC GCC GAG AGC GTC GAC 964Ala Gly Gly Phe Ser Trp Arg Arg Tyr Arg Ser Ala Glu Ser Val Asp
300 305 310AAG AGG GCC ACC ATG ACT GAT GCC GAG CTT GAG AAG AAG CTG AAC TCT 1012Lys Arg Ala Thr Met Thr Asp Ala Glu Leu Glu Lys Lys Leu Asn Ser315 320 325 330TAT GTC CAG ATG GAT AAG GAG TAT GTG AAG AAT AAC CAG GCC CGC TCT 1060Tyr Val Gln Met Asp Lys Glu Tyr Val Lys Asn Asn Gln Ala Arg Ser
335 340 345TAA CGAGGGTATG AGGTTTGATG GGAAATGACA TGATTCATGA ACGAAACCAT 1113*AGTACATATG ATGCAAATAG GATATAAAAA CATATTTCAT TCACTAGCTT TACACAA 1170SEQ ID NO：2显示了本发明的磷脂酶的氨基酸序列(2)SEQ ID NO：的信息：(i)序列特征：
(A)长度：346个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Ala Ile Thr Leu Ala Val Ala Ser1 5 10 15Pro Val Ala Leu Asp Asp Tyr Val Asn Ser Leu Glu Glu Arg Ala Val
20 25 30Gly Val Thr Thr Thr Asp Phe Ser Asn Phe Lys Phe Tyr Ile Gln His
35 40 45Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ser Lys Ile
50 55 60Thr Cys Ser Asn Asn Gly Cys Pro Thr Val Gln Gly Asn Gly Ala Thr65 70 75 80Ile Val Thr Ser Phe Val Gly Ser Lys Thr Gly Ile Gly Gly Tyr Val
85 90 95Ala Thr Asp Ser Ala Arg Lys Glu Ile Val Val Ser Phe Arg Gly Ser
100 105 110Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu Asp Phe Gly Gln Glu Asp
115 120 125Cys Ser Leu Val Ser Gly Cys Gly Val His Ser Gly Phe Gln Arg Ala
130 135 140Trp Asn Glu Ile Ser Ser Gln Ala Thr Ala Ala Val Ala Ser Ala Arg145 150 155 160Lys Ala Asn Pro Ser Phe Asn Val Ile Ser Thr Gly His Ser Leu Gly
165 170 175Gly Ala Val Ala Val Leu Ala Ala Ala Asn Leu Arg Val Gly Gly Thr
180 185 190Pro Val Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn Ala Gln
195 200 205Leu Ser Ala Phe Val Ser Asn Gln Ala Gly Gly Glu Tyr Arg Val Thr
210 215 220His Ala Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Leu Ile Phe Gly Tyr225 230 235 240Arg His Thr Thr Pro Glu Phe Trp Leu Ser Gly Gly Gly Gly Asp Lys
245 250 255Val Asp Tyr Thr Ile Ser Asp Val Lys Val Cys Glu Gly Ala Ala Asn
260 265 270Leu Gly Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu Asp Ile Ala Ala His Leu
275 280 285His Tyr Phe Gln Ala Thr Asp Ala Cys Asn Ala Gly Gly Phe Ser Trp
290 295 300Arg Arg Tyr Arg Ser Ala Glu Ser Val Asp Lys Arg Ala Thr Met Thr305 310 315 320Asp Ala Glu Leu Glu Lys Lys Leu Asn Ser Tyr Val Gln Met Asp Lys
325 330 335Glu Tyr Val Lys Asn Asn Gln Ala Arg Ser *
340 345
关于微生物保藏的说明书
(PCT第13条附则)
关于微生物保藏的说明书
(PCT第13条附则)
Form PCT/RO/134表格(1992年7月)
机译： 通过使用来自丝状真菌的具有磷脂酶A和/或B活性的磷脂酶，减少食用油中包含大量非水合磷的磷脂酶的含磷成分
机译： 通过使用磷脂酶，来自具有磷脂酶A和/或B活性的丝状真菌的磷脂酶来减少食用油中包含大量不可水合磷的含磷成分
机译： 通过使用磷脂酶，来自具有磷脂酶A和/或B活性的丝状真菌的磷脂酶来减少食用油中包含大量不可水合磷的含磷成分
