草食动物厌氧真菌与共存甲烷菌的分离鉴定及其代谢产物分析

摘要

草食动物瘤胃内栖息的微生物包括厌氧真菌、古菌、原虫和真细菌。在长期进化过程中，这些微生物间形成了相互依存，相互制约的复杂关系，并通过代谢等方面的协同作用在提高瘤胃粗纤维降解能力中发挥了重要作用。瘤胃内厌氧真菌由于其强大的粗纤维降解能力，在提高反刍动物粗饲料利用价值中扮演着尤为重要的角色。甲烷作为瘤胃代谢的终产物之一，它的产生既是动物能量的浪费，同时，也对温室效应有一定影响，因此瘤胃甲烷菌及甲烷形成机制的研究受到广泛关注。甲烷菌作为瘤胃中主要的氢利用菌，可利用厌氧真菌的代谢产物如H2、CO2、甲酸和乙酸等产生甲烷。因此，瘤胃内厌氧真菌与甲烷菌在瘤胃粗纤维降解产生甲烷过程中存在较为密切的关系。目前有关于厌氧真菌与甲烷菌代谢关系的研究主要集中在单独厌氧真菌与某些已知甲烷菌的简单混合培养，有关于自然条件下共生的厌氧真菌与甲烷菌的相互代谢机制则鲜有报道。因此本研究拟通过厌氧滚管技术获得厌氧真菌与甲烷菌自然条件下的简单共培养物，并对其中厌氧真菌与甲烷菌进行鉴定以及动态发酵研究，探讨瘤胃内厌氧真菌与甲烷菌间的共存关系，为进一步揭示瘤胃内微生物间代谢关系奠定基础。
　　第一部分:瘤胃降解粗纤维产甲烷的厌氧真菌与甲烷菌共培养物分离鉴定
　　本试验利用厌氧滚管技术从荷斯坦奶牛瘤胃中分离鉴定降解粗纤维产甲烷的厌氧真菌与甲烷菌共培养物，并通过形态学观察和DAPI染色以及甲烷菌16S rRNA基因序列分析方法分别对厌氧真菌及甲烷菌进行鉴定。共培养物中的厌氧真菌分别属于Piromyces、Neocallimastix和Caeomyces属，所占百分比为53.57％、42.86％及3.57％。甲烷菌16S rRNA基因序列分析结果表明，共培养物中的甲烷菌均为甲烷短杆菌;其中，RO簇甲烷短杆菌比SGMT簇甲烷短杆菌更占优势，所占比例分别为96.43％和3.57％。本研究共获得四种不同的厌氧真菌与甲烷菌组合，分别为Piromyces/Methanobrevibacter ruminantium、 Neocallimastix/Methanobrevibacterruminantium、Neocallimastix/Methanobrevibacter thaueri以及Caecomyces/Methanobrevibacter ruminantium，分别占总组合数的53.57％、39.29％、3.57％及3.57％。分离得到的28株厌氧真菌和甲烷菌共培养物中，占优势的为具有丰富丝状假根的厌氧真菌Piromyces和Neocallimastix以及RO簇甲烷短杆菌。本研究为进一步研究瘤胃内厌氧真菌与甲烷菌相互代谢关系奠定基础。
　　第二部分:GC-MS比较研究厌氧真菌与甲烷菌共培养物及厌氧真菌纯培养物代谢差异
　　本试验以厌氧真菌（Piromyces sp.F1）与甲烷菌（Methanobrevibacter thaueri likestrain）共培养物为试验菌株，利用氯霉素抑制共培养物中的共生甲烷菌获得厌氧真菌纯培养物。通过GC-MS比较研究厌氧真菌与甲烷菌共培养物及厌氧真菌纯培养物间胞内与胞外代谢物差异，评价甲烷菌共存对厌氧真菌代谢的影响。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)结果表明，纯培养和共培养的上清液以及细胞内容物都能够得到明显区分。两组上清液中主要差异代谢物为苹果酸、丙酮酸、柠檬酸和乳酸。厌氧真菌纯培养中的乳酸、柠檬酸和苹果酸含量显著高于厌氧真菌与甲烷菌共培养(P＜0.05），丙酮酸含量则显著低于共培养(P＜0.05）。两组细胞内容物中主要差异代谢物为柠檬酸、葡萄糖、苹果酸和丙酮酸，其中纯培养的柠檬酸含量显著低于共培养(P＜0.05），葡萄糖的含量则显著高于共培养(P＜0.05），而丙酮酸和苹果酸的含量均低于共培养组，但差异不显著(P＞0.05）。试验结果暗示甲烷菌能够使厌氧真菌氢化酶体的代谢加强，从而改变厌氧真菌的代谢途径。
　　第三部分:厌氧真菌代谢产物中有机酸的高效液相色谱检测方法的建立
　　为进一步探究厌氧真菌的代谢图谱以及存在甲烷菌的情况下厌氧真菌代谢产物的变化，本试验利用高效液相色谱法建立了一种能够迅速分析检测厌氧真菌纯培养以及与甲烷菌共培养条件下的上清液和细胞内容物中6种有机酸的方法。该方法采用5mM磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节至pH2.4)作为流动相，流速为0.5 mL/min，紫外检测波长为214nm，柱温25℃，使得甲酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸和α-酮戊二酸6种有机酸能够在14 min内得到良好分离，各种有机酸的线性相关系数均大干0.9992，检测限为0.20 ng/L-1 ng/L，该方法的回收率为92.17％-101.61％，相对标准偏差为1.07％-8.30％。应用上述方法，本试验研究了厌氧真菌纯培养及与甲烷菌共培养的上清液和细胞内容物中6种有机酸的差异。结果表明，纯培养组的上清液和细胞内容物中的甲酸都显著高于共培养组(P＜0.05），而乙酸都显著低于共培养组(P＜0.05)。琥珀酸和α-酮戊二酸在上清液和细胞内容物组中的含量都较低，且在各组中差异不显著(P＞0.05)。纯培养上清液的乳酸含量显著高于共培养(P＜0.05），而细胞内容物中的的乙醇含量显著高于共培养(P＜0.05）。总之，该法可用于厌氧真菌纯培养及与甲烷菌共培养的发酵液及细胞内容物中的的有机酸分析，试验结果表明甲烷菌存在与否对厌氧真菌的代谢产物存在较大影响。
　　第四部分:厌氧真菌与甲烷菌共培养物及厌氧真菌纯培养物发酵动态的比较研究
　　本试验结合已建立的高效液相代谢产物测定方法，以葡萄糖为底物，研究厌氧真菌组和厌氧真菌与甲烷菌共培养组发酵96 h过程中产生的代谢产物的动态变化规律，以进一步探究厌氧真菌代谢图谱以及共生情况下甲烷菌对厌氧真菌代谢途径的动态影响。结果表明，共培养组的累计产气量显著高于纯培养组(P＜0.05）。共培养组的甲酸含量在30h前与纯培养组差异不显著，48 h后共培养组甲酸迅速降低，而纯培养组甲酸不断积累。纯培养组的乳酸和乙醇始终高于共培养组，且分别在60 h和30 h后与共培养组差异显著(P＜0.05），而共培养组的乙酸含量始终高于纯培养组(P＜0.05)。共培养组和纯培养组的α-酮戊二酸、柠檬酸和琥珀酸的含量在96 h内均存在波动性上升的趋势，且纯培养组的α-酮戊二酸始终高于共培养组，而柠檬酸在60-72 h时则显著低于共培养组(P＜0.05)。试验结果暗示共存甲烷菌在动态发酵过程中显著改变厌氧真菌的代谢途径。

目录

声明

摘要

中英文对照表

引言

文献综述

1 厌氧真菌

1．1 厌氧真菌的发现与分类

1．2 厌氧真菌多样性

1．3 厌氧真菌的代谢

1．4 厌氧真菌分子学研究手段

2 瘤胃甲烷菌

2．1 甲烷菌的简介与分类

2．2 甲烷菌的分布

2．3 SGMT簇与RO簇甲烷短杆菌

3 厌氧真菌与甲烷菌的相互关系

3．1 厌氧真菌与甲烷菌体外共培养特性的研究

3．2 厌氧真菌与甲烷菌的共培养体系的建立

3．3 厌氧真菌与甲烷菌的自然共生关系的研究

3．4 共培养物中甲烷菌的鉴定方法

4 代谢组学

4．1 代谢组学在微生物学的研究进展

4．2 微生物代谢组学的分析方法

4．3 小结

5 本文研究的目的和意义

参考文献

第一章 瘤胃降解粗纤维产甲烷的厌氧真菌与甲烷菌共培养物的分离鉴定

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 主要试剂和仪器

2 结果与分析

2．1 共培养中厌氧真菌的鉴定

2．2 共培养物中甲烷菌的鉴定

2．3 共培养中厌氧真菌与甲烷菌相互关系

3 讨论

参考文献

第二章 GC-MS比较研究厌氧真菌与甲烷菌共培养物及厌氧真菌纯培养物代谢差异

1 材料和方法

1．1 培养基成分及其配制

1．2 菌种来源

1．3 微生物培养

1．4 代谢组学样品收集

1．5 GC-MS样品配制

1．6 GC／MS分析与数据采集

1．7 化合物鉴定与数据处理

1．8 数据处理

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第三章 厌氧真菌代谢产物中有机酸的高效液相色谱检测方法的建立

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 高效液相色谱法的建立

1．3 发酵液中乙醇浓度测定

1．4 数据处理

1．5 仪器与试剂

2 结果与分析

2．1 检测波长的选择

2．2 流动相的选择

2．3 色谱柱的选择

2．4 保留时间

2．5 标准曲线及检测限

2．6 精密度和回收率测定

2．7 厌氧真菌纯培养与甲烷菌共培养中上清液及细胞内容物中的代谢产物定量分析

3 讨论

参考文献

第四章 厌氧真菌与甲烷菌共培养物及厌氧真菌纯培养物发酵动态的比较研究

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 主要试剂和仪器

1．4 数据处理

2 结果与分析

2．1 厌氧真菌与甲烷菌的共培养组及厌氧真菌纯培养组发酵96 h的pH动态变化

2．2 厌氧真菌与甲烷菌的共培养组及厌氧真菌纯培养组发酵96 h累积产气量的动态变化

2．3 厌氧真菌与甲烷菌的共培养组及厌氧真菌纯培养组发酵96 h甲烷产量的动态变化

2．4 共培养组与纯培养组发酵96 h过程中有机酸的发酵变化规律

3 讨论

参考文献

全文结论

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文