绵羊体外胚胎生产技术的研究

摘要

自克隆绵羊“多莉”诞生以来，体细胞克隆技术已经历十多年的发展，但生产克隆绵羊的效率仍然很低，且绵羊体外胚胎生产技术的每一环节都会对其造成影响。为筛选并优化一套适于绵羊体外受精与体细胞克隆胚胎生产的方法体系，进一步提高绵羊体外胚胎生产效率，本研究以屠宰场采集绵羊卵巢、妊娠30d绵羊胎儿和成年敖汉细毛羊耳缘组织为实验材料，重点研究并优化了卵母细胞采集、体外成熟、供体细胞培养、体细胞核移植和胚胎体外培养等技术环节，具体研究内容及结果如下。
　　比较了卵泡冲洗法、剖切法、注射器抽吸法和真空泵抽吸法对采集卵母细胞质量和数量的影响;比较了成熟培养液中添加BIONICHE或宁波激素厂FSH/LH、添加发情绵羊血清(ESS)或胎牛血清(FBS)对卵母细胞成熟率的影响;比较了mSOF和mCR培养体系对绵羊体外受精胚胎囊胚率的影响。结果表明，卵泡冲洗法获得A、B两级卵母细胞比例显著高于其余三种方法(P＜0.05);成熟液联合添加ESS和FSH/LH(BIONICHE)，卵母细胞成熟率显著高于其他添加方式(P＜0.05);mSOF和mCR胚胎培养体系卵裂率无显著差异(P＞0.05)，但mSOF组囊胚率和孵化率均显著高于mCR组(P＜0.05)。
　　建立了绵羊胎儿与耳缘成纤维细胞系并进行传代培养，探究了绵羊体细胞培养体系、体细胞生长曲线与细胞核型。研究结果表明，绵羊耳缘成纤维细胞在DMEM/F12培养基中生长速度、传代过程细胞贴壁率和细胞形态均优于DMEM培养基;细胞生长曲线表明，绵羊胎儿和耳缘成纤维细胞均呈现S型生长特点，且胎儿成纤维细胞生长速度明显快于后者;核型分析结果表明，建立的胎儿与耳缘成纤维细胞系处于正常染色体数核型的比例较高。
　　卵母细胞体外成熟培养后，采用微电极融合、无透明带克隆与显微注射等核移植方法进行核移植，比较胚胎构建效率，利用绵羊孤雌激活摸索胚胎培养液中添加维生素C最适浓度，将该浓度用于克隆胚胎体外培养，统计胚胎发育情况。结果表明，25V电压微电极融合法的融合率显著高于平行电极融合法(P＜0.05)，但与30 V电压微电极融合法差异不显著（P＞0.05）。采用25 V电压微电极融合法死卵率显著低于30 V融合法(P＜0.05);无透明带融合法构建克隆胚胎的桑葚胚率显著高于显微注射法（P＜0.05），但两种方法获得卵裂率和囊胚率差异均不显著（P＞0.05）;胚胎培养液中添加50μM维生素C可显著提高绵羊孤雌激活与体细胞克隆胚胎囊胚率(P＜0.05)。
　　以上结果表明，应用改进的卵泡冲洗法采集绵羊卵母细胞可显著提高采集质量和数量。成熟液中联合使用10μg/mL FSH/LH(BIONICHE)激素和ESS，可显著提高绵羊卵母细胞成熟率;DMEM/F12培养基较适合绵羊耳缘成纤维细胞生长。建立的绵羊胎儿与耳缘成纤维细胞系均可用于体细胞克隆研究。显微注射克隆方法中，采用25V微电极融合法可显著提高融合效率。无透明带融合法不能显著提高绵羊克隆胚胎囊胚率。mSOF体外胚胎培养体系中添加50μM维生素C可显著提高绵羊孤雌激活与体细胞克隆胚胎囊胚率。

目录

声明

摘要

缩略符号

文献综述

1 家畜卵母细胞体外成熟研究进展

1．1 卵母细胞来源与质量决定其发育能力

1．2 卵母细胞与卵丘细胞的相互作用

1．3 体外成熟培养环境影晌卵母细胞内mRNA蓄积

2 家畜体细胞核移植技术研究进展

2．1 体细胞核移植技术主要方法

2．2 体细胞核移植过程中表观遗传重编程

2．3 体细胞核移植技术应用

3 家畜胚胎体外培养研究进展

3．1 家畜胚胎体外培养体系

3．2 体外胚胎培养环境影响囊胚质量

3．3 体外培养环境影响基因表达

3．4 胚胎体外培养引起的产后巨胎症

4 本研究目的意义和主要内容

4．1 绵羊体外受精与体细胞克隆技术存在的问题

4．2 本研究的目的意义及研究内容

参考文献

第一章 绵羊体外受精胚胎生产技术的优化

1 材料与方法

1．1 试剂来源与溶液配制

1．2 发情绵羊血清的制备

1．3 绵羊卵巢采集

1．4 卵母细胞采集

1．5 卵母细胞体外成熟

1．6 体外受精

1．7 胚胎体外培养

1．8 数据处理与分析

2 结果与分析

2．1 采集方法对卵母细胞质量和数量的影响

2．2 激素和血清对卵母细胞成熟率的影响

2．3 培养体系对体外受精胚胎囊胚囊胚率的影响

3 讨论

3．1 采集方法对卵母细胞利用效率的影响

3．2 成熟液中添加不同种类激素和血清对卵母细胞成熟率的影响

3．3 培养体系对体外受精胚胎囊胚率的影响

4 本章小结

参考文献

第二章 绵羊胎儿与耳缘成纤维细胞系的建立

1 材料与方法

1．1 试剂来源与溶液配制

1．2 细胞系的建立

1．3 细胞传代、冻存与复苏

1．4 绵羊5代胎儿成纤维细胞分离纯化与生长曲线绘制

1．5 绵羊胎儿成纤维细胞核型分析

2 结果与分析

2．1 绵羊体细胞基础培养液的筛选

2．2 绵羊胎儿与耳缘成纤维细胞系的建立与生长曲线绘制

2．3 绵羊5代成纤维细胞核型分析

3 讨论

3．1 不同基础培养液对绵羊成纤维细胞生长的影晌

3．2 绵羊胎儿与耳缘成纤维细胞生长曲线比较

3．3 绵羊成纤维细胞核型分析

4 本章小结

参考文献

第三章 核移植方法和维生素C影响绵羊克隆胚胎体外发育

1 材料与方法

1．1 试剂来源与溶液配制

1．2 绵羊卵母细胞体外成熟培养

1．3 卵母细胞去核

1．4 去核成功的检测

1．5 供体细胞准备

1．6 显微注射法构建重构胚

1．7 无透明带融合法构建重构胚

1．8 卵母细胞孤雌激活

1．9 重构胚激活与体外培养

1．10 数据处理与分析

2 结果与分析

2．1 显微注射克隆法中融合方法和融合参数对重构胚融合效率的影响

2．2 不同克隆胚胎构建方法对绵羊克隆胚胎发育效率的影响

2．3 不同浓度维生素C对绵羊孤雌胚胎囊胚囊胚率的影响

2．4 维生素C对绵羊孤雌囊胚细胞数的影响

2．5 维生素C对绵羊体细胞克隆胚胎囊胚率的影响

3 讨论

3．1 融合方法与融合参数对构建绵羊体细胞克隆胚胎效率的影响

3．2 核移植方法对绵羊克隆胚胎囊胚率的影响

3．3 维生素C对绵羊体细胞克隆胚胎发育的影响

4 本章小结

参考文献

全文结论

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文