鹰嘴豆NAC转录因子CarNAC4、CarNAC5和CarNAC2参与逆境胁迫响应的功能分析

摘要

干旱、盐碱等逆境胁迫严重影响了我国的农业生产。鹰嘴豆作为世界第三大豆类作物，主要生长在干旱、半干旱地区的，抗逆性强，已进化出一套高效的抗逆机制。因此，鹰嘴豆适合用于挖掘抗逆关键基因和解析植物抗逆分子机制。本实验室于2007年利用新疆抗逆鹰嘴豆种质构建了干旱胁迫相关的cDNA文库，并根据该cDNA文库信息，克隆了6个NAC转录因子基因，命名为CarNA C1～6。这6个基因都具有NAC家族的典型结构，并且都能不同程度的响应逆境胁迫和激素信号的诱导。越来越多的研究表明NAC转录因子在植物发育和生长调节以及逆境应答分子网络中扮演着极其重要的角色，是作物抗逆遗传工程的优良候选资源。因此，我们挑选其中的CarNAC4、CarNAC5和CarNAC2三个基因，详细研究了他们响应逆境胁迫和激素信号的表达情况，分析了启动子序列的结构以及他们与DNA元件的结合情况，并通过转基因拟南芥对他们的功能进行了研究。本研究的主要研究结果如下:
　　1.通过对CarNAC4、CarNAC5和CarNAC2三个基因逆境胁迫和激素处理后的mRNA转录水平分析发现:CarNAC4基因在干旱、高盐、高温和低温处理后表达量明显上升，在ABA、IAA、MeJA和H2O2处理之后表达量也明显上升;CarNAC5基因的表达量在干旱和高温诱导后明显上升，同时还会受到IAA的诱导;CarNAC2基因的表达则仅能受到干旱胁迫和外源ABA的诱导。3个鹰嘴豆NAC家族在响应逆境胁迫和激素信号功能上既表现出协同性又各自具有不同的响应模式。
　　2.采用Genome Walking技术分别克隆CarNAC4和CarNAC5基因上游的启动子片段，经过PLACE等在线软件预测分析发现:CarNAC4启动子中包含NAC、MYB、MYC、W盒、DRE、LTRE、PRE等多种逆境相关的转录因子结合元件，还包含ABRE等多种响应激素信号的顺式作用元件;CarNAC5启动子中同样既包含NAC、MYB、MYC、W盒等逆境响应元件，也包括ABRE、GARE、EEC等激素响应元件。两个启动子中这些响应逆境和激素信号的元件在数量和分布上都有较大差异，表明了CarNAC4和CarNAC5基因能够以不同的模式来响应逆境胁迫和激素信号。
　　3.通过非放射性EMSA实验证实，经原核表达的CarNAC4和CaNAC5蛋白能够在体外与包含NACRS核心序列的探针特异性结合;采用酵母单杂交技术也证实了CarNAC4和CarNAC5蛋白能够在真核生物酵母体内和NAC蛋白的核心结合序列CGT[A/G]特异性的结合。为进一步研究鹰嘴豆CarNAC4和CarNAC5蛋白对下游基因的调控奠定了基础。
　　4.在拟南芥中过量表达CarNA C4基因后，分别从表型、生理和分子水平分析转基因拟南芥的抗逆性，结果发现CarNAC4基因的过表达拟南芥种子在干旱和盐胁迫条件下具有更高的发芽速率，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥幼苗经过干旱胁迫和盐胁迫后展现了更高的存活率，并且转基因拟南芥叶片中脯氨酸的含量明显高于野生型拟南芥，而受胁迫产生的丙二醛含量低于野生型，转基因拟南芥离体叶片展现了较低的失水速率。另外，干旱胁迫下，6个逆境相关基因（RD29A，ERD10，COR15A，COR47, KIN1，DREB2A）的表达量在转基因拟南芥内明显高于野生型拟南芥。CarNAC4基因的过量表达没有明显改变拟南芥植株的生长发育过程但提高了它的抗旱和耐盐能力，在作物逆境基因工程方面展现出较大的应用潜力。
　　5.在拟南芥中过量表达CarNAC5基因后，同样从表型、生理和分子水平分析了转基因拟南芥的抗逆性，结果发现CarNAC5基因的过表达拟南芥种子在干旱胁迫条件下具有更高的发芽速率，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥幼苗经过干旱胁迫后展现了更高的存活率，并且转基因拟南芥叶片中脯氨酸的含量明显高于野生型拟南芥，转基因拟南芥离体叶片展现了较低的失水速率。另外，干旱胁迫下，5个逆境相关基因（RD22，RD29A，ERD10，COR15A，DREB2A）的表达量在转基因拟南芥内明显高于野生型拟南芥。同CarNA C4基因一样，CarNAC5基因在作物抗逆基因工程上也具有潜在的应用价值。
　　6.在拟南芥中过量表达CarNAC2基因后，转基因拟南芥种子的萌发延迟，发芽速率减慢，与野生型拟南芥相比，转基因幼苗下胚轴变短，成年植株开花延迟。经过干旱胁迫后，转基因拟南芥的存活率更高，叶片中能够积累更多的脯氨酸。离体状态下，转基因拟南芥的叶片水分散失速率更慢。另外，干旱胁迫后，转基因拟南芥中4个逆境相关基因（COR15A，RD22，RD29A，KIN1）mRNA水平明显高于野生型植株。以上结果表明了CarNAC2基因能够在提高植株抗旱性，为通过基因工程改良植物的抗旱性提供了候选基因。
　　本研究通过对鹰嘴豆3个NAC家族转录因子（CarNAC4、CarNAC5和CarNAC2）的表达模式、启动子结构、结合活性以及过表达拟南芥功能等方面的分析，初步阐明了3个基因响应非生物胁迫的分子机制，为进一步通过遗传工程改良作物抗逆性奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 鹰嘴豆分子生物学研究进展

2 植物NAC转录因子的研究进展

2．1 NAC在响应逆境胁迫中的功能

2．2 NAC转录因子的表达调控

2．3 NAC蛋白结合的顺式作用元件及对下游基因的调控

2．4 NAC转录因子在提高植物抗逆性上的应用

3 植物逆境相关转录因子的研究方法

3．1 基因表达模式的分析

3．2 顺式作用元件的分析

3．3 转录因子调控机制的研究

3．4 基因功能的研究

4 本研究的目的与意义

第二章 CarNAC4、CarNAC5和CarNAC2基因的表达模式分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 CarNAC4基因表达分析

3．2 CarNAC5基因表达分析

3．3 CarNAC2基因表达分析

4 讨论

4．1 CarNAC基因能够以不能的模式响应逆境胁迫

4．2 CarNAC基因能够以不能的模式响应激素信号

4．3 CarNAC5基因能够响应高温胁迫诱导

第三章 CarNAC4、CarNAC5启动子的克隆及顺式作用元件分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 CarNAC4基因启动子序列的获得

3．2 CarNAC5基因启动子序列的获得

3．3 CarNAC4基因启动子序列顺式作用元件的预测与分析

3．4 CarNAC5基因启动子序列顺式作用元件的预测与分析

4 讨论

4．1 CarNAC基因上游序列具备启动子的典型特征

4．2 CarNAC基因启动子中存在ABRE元件

4．3 CarNAC基因启动子中存在响应逆境的元件

4．4 CarNAC基因启动子中存在NAC转录因子的结合元件

第四章 CarNAC4和CarNAC5蛋白的结合活性分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 CarNAC4和CarNAC5蛋白与NACRS的体外结合

3．2 CarNAC4和CarNAC5蛋白与NACRS的体内结合

4 讨论

4．1 NAC蛋白能够结合多种顺式作用元件

4．2 CarNAC蛋白与同源蛋白具有相同的结合特性

4．3 NAC蛋白能够通过结合顺式作用元件调控下游基因的表达

第五章 CarNAC4在拟南芥中的表达及抗逆性分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 pBI121重组载体的检测

3．2 农杆菌转化子的检测

3．3 转CarNAC4基因拟南芥植株的阳性检测

3．4 CarNAC4基因过表达拟南芥植株的抗旱性分析

3．5 CarNAC4基因过表达拟南芥植株的耐盐性分析

3．6 转基因拟南芥中逆境相关基因的转录水平分析

4 讨论

4．1 CarNAC4基因的过表达对逆境相关生理指标的影响

4．2 CarNAC4基因的过表达增强了拟南芥的抗逆性

4．3 CarNAC4基因的过表达促进了逆境相关基因的转录

4．4 CarNAC4基因具有潜在的遗传改良应用前景

第六章 CarNAC5在拟南芥中的表达及抗逆性分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 pBI121重组载体的检测

3．2 农杆菌转化子的检测

3．3 转CarNAC5基因拟南芥植株的阳性检测

3．4 CarNAC5基因过表达拟南芥植株的抗旱性分析

3．5 转基因拟南芥中逆境相关基因的转录水平分析

4 讨论

4．1 CarNAC5基因可能通过不依赖ABA途径响应逆境胁迫

4．2 CarNAC4和CarNAC5在响应逆境胁迫上的异同点

第七章 CarNAC2在拟南芥中的表达及抗逆性分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 CarNAC2过表达拟南芥植株形态学调查

3．2 CarNAC2过表达拟南芥植株的抗旱性调查

3．3 转基因拟南芥中逆境相关基因的转录水平分析

4 讨论

4．1 CarNAC2基因能够延缓植株的生长发育进程

4．2 CarNAC2基因可能通过ABA信号途径调节种子休眠和萌发

4．3 CarNAC2基因能够增强植株的抗旱性

4．4 CarNAC基因抗逆性的比较

全文总结

本研究创新之处

参考文献

攻读博士期间发表的论文

致谢