鹰嘴豆NAC转录因子CarNAC4、CarNAC6的功能分析

摘要

干旱问题严重影响着全球作物的产量，威胁着传统农业的可持续发展。NAC转录因子（矮牵牛的NAM、拟南芥的ATAF1、ATAF2以及CUC的首字母缩写）在植物生长发育以及响应各种胁迫中发挥着重要作用，特别是在植物应对逆境胁迫中的作用更是不可忽视。但目前对NAC转录因子的研究主要集中于水稻和拟南芥等模式作物，在其他植物中的研究较少。鹰嘴豆是世界第三大豆类作物，由于常年生长于干旱、半干旱地区，已进化出完整高效的机制来适应干旱胁迫。因此，鹰嘴豆在挖掘抗逆基因和解析植物抗逆的分子机制方面有巨大潜力。实验室前期利用新疆抗逆鹰嘴豆种质构建了干旱胁迫相关的cDNA文库，并从中克隆了6个编码NAC转录因子的基因，命名为CarNAC1～CarNAC6。通过对这6个基因进行初步研究发现，这6个基因都具有典型的NAC结构，并能够不同程度的响应逆境胁迫和激素处理的诱导。我们挑选其中的CarNAC4、CarNAC6以及与ZF2（编码与CarNAC4互作的ZF2蛋白）为研究对象，从以下方面进行了研究: 1.通过EMSA实验验证了纯化后的CarNAC6蛋白能够在体外与包含NACRS核心序列的探针特异性结合;利用酵母单杂交实验验证了CarNAC6蛋白与NACRS序列以及包含NACRS核心元件的Core片段在真核生物酵母体内的特异性结合。证明了NAC转录因子DNA结合元件的保守性，为进一步研究CarNAC6调控的下游基因奠定了基础。 2.在拟南芥中过表达CarNAC6基因，通过观察其表型，发现转基因拟南芥与野生型植株在幼苗阶段的下胚轴长度以及开花时间方面存在差异，但不存在转基因株系植株矮小等情况。在干旱胁迫处理下，转基因拟南芥植株的存活率、脯氨酸含量显著高于野生型。在盐胁迫下，转基因拟南芥的根长发育受抑制程度低于野生型，而ABA处理下，转基因拟南芥的根长受抑制程度要高于野生型。以上结果表明，CarNAC6基因的过表达能够增强转基因拟南芥对干旱的耐性，而且其过表达没有明显改变拟南芥植株的生长发育过程，在作物抗逆基因工程方面具有潜在的应用价值。 3.根据CarNAC4基因启动子上顺式作用元件的位置对其进行了5'端缺失，构建了含有不同启动子5'端缺失片段的植物表达载体，通过农杆菌介导侵染烟草叶片的GUS基因瞬时表达分析以及转基因拟南芥植株的GUS基因稳定表达分析，发现CarNAC4基因启动子中驱动基因表达的核心序列位于其转录起始位点上游280bp内。通过对包含CarNAC4基因启动子全长的转基因拟南芥植株不同时期不同部位进行GUS组织化学染色分析发现，其表达部位主要是幼苗的叶片以及成熟的叶片、花和荚中。此外，荧光定量实验结果表明，不同启动子片段对于干旱、盐以及ABA处理的响应模式各有不同。 4.以CaNAC4为诱饵，通过酵母双杂交实验证实CarNAC4蛋白既能够与自身互作形成同源二聚体，也能够与CarNAC1互作形成异源二聚体，而且其互作除了N端之外，还需要部分C端的参与。此外，我们构建了二聚体形成关键氨基酸的缺失突变体和替换突变体，经酵母双杂交实验证明经缺失和替换后，CarNAC4蛋白无法形成二聚体，验证了关键氨基酸对于NAC二聚体化的重要性，为下一步研究NAC蛋白二聚体化的功能奠定了基础。 5.通过酵母双杂交技术以及双分子荧光互补(BiFC)实验分别验证了CaNAC4蛋白与ZF2蛋白的互作，而且互作位于细胞核上。随后对ZF2蛋白进行亚细胞定位实验，结果表明其位于细胞核上，与互作位置一致。ZF2基因在不同逆境和外源激素处理下的表达模式分析实验发现，ZF2基因能够响应干旱、高盐、高低温胁迫以及ABA、IAA、MeJA、H2O2的诱导，而且，在干旱胁迫处理下ZF2基因与前期研究中的CarNAC4基因的表达水平存在极为相似的变化趋势。因此，我们推测，CarNAC4蛋白和ZF2蛋白可能通过互作共同调控植物响应干旱胁迫。 6.构建进化树发现，ZF2蛋白与大豆GmZAT10-like和SCOF-1蛋白的同源性最高，通过与其他功能已知锌指蛋白进行序列比对发现，ZF2是一个典型的C2H2型锌指蛋白，其结构包含一段与亚细胞定位有关的核定位信号NLS(B-box)，富含亮氨酸的L-box，两个保守的锌指结构域，以及转录抑制或者转录激活活性相关的DLNbox/EAR-motif。分离得到了ZF2基因上游2461bp的序列并进行顺式作用元件预测分析发现，ZF2基因的启动子中存在多种响应胁迫和激素诱导的顺式作用元件，对得到的包含ZF2基因启动子的转基因拟南芥进行GUS染色发现其表达部位主要是幼苗的叶片、茎以及成熟的叶片、花和荚中。对ZF2蛋白的全长、删除DLN结构域的N端以及仅包含DLN结构域的C端进行转录激活分析发现，ZF2蛋白的全长以及删除DLN结构域的N端均不具有转录激活活性，而仅包含DLN结构域的C端却具有转录激活活性。通过农杆菌介导的拟南芥侵染，得到了ZF2基因过表达的拟南芥植株，以野生型拟南芥为对照，进行甘露醇胁迫处理发现，转基因拟南芥的根长和鲜重均明显高于野生型。干旱胁迫处理下，转基因拟南芥的存活率和脯氨酸含量要显著高于野生型，表明ZF2基因的过表达能够增强拟南芥植株的抗旱能力，同时证明了我们关于ZF2与CaNAC4通过互作共同参与植物响应干旱胁迫的推测。 本研究通过对CarNAC4转录因子的启动予功能、同源异源二聚体化、互作蛋白研究以及CarNAC6转录因子的结合活性、过表达拟南芥的功能等进行分析，对2个鹰嘴豆NAC转录因子的功能特性进行了初步研究，并对CarNAC4转录因子以及ZF2转录因子参与响应干旱胁迫的分子机制进行了解析，为利用基因工程进行作物抗逆改良奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章文献综述

1 NAC转录因子的结构

1．1 NAC结构域

1．2转录调控区域TRR

2 NAC转录因子的生物学功能

2．1 NAC转录因子参与调控植物次生生长

2．2 NAC转录因子参与调控植物衰老过程

2．3 NAC转录因子参与植物激素信号转导

2．4 NAC转录因子参与调控植物的抗病性

2．5 NAC转录因子参与植物响应非生物胁迫

3 鹰嘴豆中的NAC转录因子

4本研究的目的与意义

第二章CarNAC6蛋白与启动子目标元件的结合分析

1．1实验材料

1．2实验方法

2结果与分析

2．1体外实验分析CarNAC6蛋白与目标元件的结合

2．2体内实验分析CarNAC6蛋白与目标元件的结合

3讨论

第三章CarNAC6转基因拟南芥功畿分析

1材料与方法

1．1实验材料

1．2实验方法

2结果与分析

2．2 CarNAC6转基因拟南芥植株干旱胁迫下的存活率

2．3 CarNAC6转基因拟南芥植株干旱胁迫下叶片中的脯氨酸含量

2．4 CarNAC6转基因拟南芥植株NaCl处理下的根长测定

2．5 CarNAC6转基因拟南芥植株ABA处理下的根长测定

3讨论

第四章CarNAC4启动子的功能分析

1．1实验材料

1．2实验方法

2结果与分析

2．1CarNAC4基因启动子5’端缺失体的瞬时表达分析

2．2 CarNAC4基因启动子5’端缺失体在转基因拟南芥中的表达分析

3讨论

第五章CarNAC4蛋白二聚体化研究

1．1实验材料

1．2实验方法

2结果与分析

2．1 CarNAC蛋白N端自激活活性

2．2 CarNAC4蛋白同源和异源二聚体

2．3 CarNAC4蛋白二聚体化中的关键氨基酸

3讨论

第六章CarNAC4与ZF2蛋白互作的验证

1材料与方法

1．1实验材料

1．2实验方法

2结果与分析

2．1酵母双杂交验证CarNAC4与ZF2的互作

2．2双分子荧光互补(BiFC)验证CarNAC4与ZF2的互作

2．3 ZF2蛋白的亚细胞定位

2．4 ZF2基因的表达模式分析

3讨论

第七章ZF2基因参与干旱胁迫的功能分析

1．1实验材料

1．2实验方法

2结果与分析

2．1 ZF2的生物信息学分析

2．2 ZF2基因启动子的顺式作用元件分析

2．3 ZF2基因启动子过表达拟南芥的获得以及GUS染色分析

2．4 ZF2的转录激活活性分析

2．5 ZF2转基因拟南芥植株的鉴定

2．6 ZF2转基因拟南芥的抗旱性分析

3讨论

全文总结

本研究创新之处

参考文献

附录

在读期间发表的论文

致谢