低能氮离子注入诱变选育云芝新菌株的研究

摘要

云芝(Coriolus versicolor)是一种分布广泛的食药用真菌，近年来的研究发现，云芝中所含的云芝多糖具有增强免疫力、抑制肿瘤、镇痛抗炎、保肝护肝、抗氧化、抗衰老等功效，这不仅使云芝成为理想的药材，更使它成为保健食品及功能性食品的重要原材料。本实验将以江苏安惠生物科技有限公司提供的云芝AHSWYZ-07菌株为出发菌株，利用低能N+离子注入诱变云芝AHSWYZ-07菌株的原生质体，期望选育出一株云芝多糖高产新菌株，并对该新菌株的液体发酵进行了优化研究，以进一步提高云芝多糖的产量。
　　本文选用溶壁酶去除云芝AHSWYZ-07的细胞壁，分别研究了菌龄、温度、时间、pH值等条件对制备云芝SY-1027菌株原生质体的影响，通过实验得知，当选择菌龄为5天的云芝AHSWYZ-07菌株，以0.6mol/L的蔗糖做渗透压稳定剂，在pH为6，温度为30℃时，经2.00％的溶壁酶酶解5小时，所制备的原生质体数量最多，为8.31×105个/ml。
　　通过不同浓度的低能N+离子注入诱变云芝AHSWYZ-07菌株的原生质体，发现其存活率曲线呈现典型的“马鞍形”，印证了作者所做的本次低能氮离子诱变实验是可行且成功的。通过实验可得，当注入剂量为10×1014 ions/ cm2，注入能量为20KeV时，诱变的效果最好。
　　本实验通过对1143株诱变菌株的筛选，最终得到一株优良新菌株:云芝SY-1027菌株。在培养基配方为:葡萄糖4％，豆粕粉2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B110mg/L，pH自然;发酵条件为:转速140转/min，温度28℃，接种量10％，装液量100mL/300mL，时间为培养6天的条件下培养，云芝SY-1027菌株的液体发酵生物量为21.92g/L，胞内多糖含量为2.27g/L，分别比云芝AHSWYZ-07菌株提高了16.22％和17.62％。在传代10代后，该菌株生物量和胞内多糖含量变化不大，说明该菌株遗传稳定性良好。
　　在获得云芝SY-1027高产菌株的基础上，本文以胞内多糖为指标，用摇瓶发酵培养的方式，利用培养基单因素试验和培养基正交实验，对云芝SY-1027菌株的液体发酵培养进行了优化，确定了最佳培养基为:葡萄糖4.00％，玉米粉2.50％，豆粕粉1.75％，玉米浆干粉0.30％，磷酸二氢钾0.10％，硫酸镁0.08％，维生素B110mg/L;最佳培养条件为:起始pH自然、转速140r/min、装液量100mL/500mL、接种量15％、温度28℃;发酵时间为6天。本实验室在上述培养条件下，对云芝SY-1027菌株进行液体发酵的生物量为28.13g/L，胞内多糖含量为2.94g/L，产量与液体发酵培养的优化前相比，分别提高了28.33％和29.52％。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 云芝简介

1．1．1 云芝的分类

1．1．2 云芝的形态

1．1．3 云芝的分布

1．1．4 云芝的生长及栽培条件

1．1．5 云芝的保健成分

1．1．6 云芝的保健作用

1．1．7 云芝在食品、药品中的应用

1．2 原生质体育种技术

1．3 低能离子注入诱变技术

1．3．1 离子束生物技术的兴起

1．3．2 低能离子束注入诱变的特点

1．3．3 低能离子注入诱变的机理简介

1．3．4 低能离子注入诱变在微生物诱变育种中的应用

1．4 云芝菌丝体的液体深层发酵

1．5 立题意义

1．6 主要研究内容

第二章 云芝AHSWYZ——07菌株原生质体制备条件研究

2．1 引言

2．2 材料

2．2．1 供试菌株

2．2．2 培养基

2．2．3 主要试剂

2．2．4 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 云芝菌丝体培养

2．3．2 云芝原生质体制备

2．3．3 菌龄对云芝原生质体制备的影响

2．3．4 酶解温度对云芝原生质体制备的影响

2．3．5 酶解时间对云芝原生质体制备的影响

2．3．6 酶解pH值对云芝原生质体制备的影响

2．4 结果与分析

2．4．1 菌丝体培养分析

2．4．2 菌龄对云芝原生质体制备的影响

2．4．3 温度对云芝原生质体制备的影响

2．4．4 酶解时间对云芝原生质体制备的影响

2．4．5 酶解pH值对云芝原生质体制备的影响

2．5 本章小结

第三章 低能N+离子诱变选育云芝新菌株

3．1 引言

3．2 材料

3．2．1 供试菌株

3．2．2 培养基

3．2．3 主要试剂

3．2．4 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．1 云芝菌丝体培养

3．3．2 云芝原生质体制备

3．3．3 原生质体精制

3．3．4 云芝原生质体再生

3．3．5 低能氮离子诱变处理

3．3．6 原生质体存活率计算

3．3．7 原生质体突变统计

3．3．8 菌株筛选方法

3．4 结果与讨论

3．4．1 注入剂量对原生质体存活率的影响

3．4．2 注入剂量对原生质体突变率的影响

3．4．3 初筛的结果

3．4．4 复筛的结果

3．4．5 遗传稳定性实验的结果

3．4．6 讨论

3．5 本章小结

第四章 云芝SY-1027液体发酵培养的优化

4．1 引言

4．2 材料

4．2．1 供试菌株

4．2．2 培养基

4．2．3 主要试剂

4．2．4 主要仪器

4．3 实验方法

4．3．1 培养条件

4．3．2 培养基优化

4．3．3 云芝SY-1027菌株发酵条件优化

4．4 结果与分析

4．4．1 发酵培养基优化

4．4．2 发酵条件优化

4．5 本章小结

第五章 全文结论

参考文献

致谢