大黄素对团头鲂代谢、免疫及抗氧化调节作用的差异蛋白质组学研究

摘要

在水产养殖过程中，鱼类经常会受到各种来自外界的不良应激，导致鱼体生长受阻，严重时会导致鱼病爆发，甚至死亡，影响了水产食品安全以及水产养殖业的发展。因此，提高鱼体免疫力、减少病害已是大家关注的热点。大黄素是中草药大黄的主要提取成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗应激、增强免疫力、诱食、营养以及改善水质等多重功效。作为免疫增强剂，中草药没有抗生素和化学药品存在的耐药性等弊端，既能防治水产动物病害，又能够作为营养素促进消化吸收和生长，成为抗生素、激素和其他化学药品替代研究的热点，已被广泛应用于人类疾病防控以及养殖业。
　　团头鲂（Megalobrama amblycephala）是我国重要的淡水养殖品种，鉴于养殖过程中的疾病易爆发等问题，本研究旨在通过蛋白质组学的研究方法确定饲料中添加大黄素对团头鲂肝脏差异蛋白质组的影响，了解代谢、抗氧化及免疫相关差异表达蛋白的相互作用机制，为大黄素在团头鲂养殖中的应用提供理论依据。主要研究内容如下:
　　1.日粮添加大黄素的团头鲂肝脏差异蛋白质组分析
　　本实验旨在利用基于双向电泳的蛋白质组学方法分离并鉴定饲料中添加30mg/kg大黄素后团头鲂肝脏的差异表达蛋白。结果显示，以表达丰度差异2倍以上为基准，共分离得到团头鲂肝脏差异表达蛋白质点39个，成功鉴定38个，其中表达上调蛋白质点8个，表达下调蛋白质点30个，共包括25种不同蛋白质。依据GO数据库的生物功能注释，以蛋白质参与的生物学过程和分子功能为依据，分离的差异蛋白质点可以分为十类，包括糖代谢蛋白12个（8种，占31％），能量代谢蛋白8个(3种，占20％)，免疫相关蛋白1个（1种，占2％），细胞骨架蛋白4个(2种，占10％)，伴侣蛋白2个（2种，占5％），信号转导蛋白1个（1种，占3％），抗氧化蛋白5个（2种，占13％），辅酶因子和维生素蛋白1个（1种，占3％），氨基酸代谢蛋白3个（3种，占5％），核苷酸代谢蛋白2个（2种，占8％）。
　　2.差异表达蛋白的互作网络分析及基因功能注释
　　本实验旨在利用NCBI、STRING、DAVID、GO等数据库的相关数据，通过 Cytoscape软件构建团头鲂肝脏差异表达蛋白的互作网络模型，并对差异表达蛋白基因进行功能注释。结果显示，在25种差异表达的蛋白中，有18种在机体的互作调控网络中起重要作用，分别为ApoA1、ALDOB、GAPDH、TP53、 GPx1、GST、HSP70、Bhmt1、EEF2b、FTCD、Aldh8a1、Aldh9a1a、LDHBB、Eno3、Pgk1、ME1、ETFA和AST。其中ApoA1、ALDOB、GAPDH、TP53、GPx1、GST和HSP70在大黄素对团头鲂的抗氧化应答过程中扮演重要角色，且除ALDOB和TP53外均表达上调。差异表达蛋白基因的GO功能注释结果表明，差异表达蛋白基因主要参与机体代谢过程中的氧化还原反应，同时还参与了糖酵解、葡萄糖分解、单糖分解、己糖分解、乙醇分解、细胞碳水化合物分解等过程。在已经检索到的信息中，TP53、Aldh9a1a、ME1、Aldh8a1、LDHBB、Sord、ALDOB、HSP70和GPx1均参与了氧化代谢过程，与Cytoscape软件的分析结果相吻合，说明ApoA1、ALDOB、GAPDH、TP53、GPx1、GST和HSP70蛋白在团头鲂抗氧化代谢中起重要作用。
　　3.差异表达蛋白的转录水平表达量验证及功能分析
　　本实验旨在利用RT-PCR技术对差异表达蛋白进行转录水平的表达量验证，并初步探讨代谢、抗氧化及免疫相关蛋白的调控关系。结果表明，30 mg/kg大黄素添加组抗氧化相关蛋白ApoA1、ALDOB、GAPDH、HSP70、GPx1和GST的mRNA表达量均显著高于对照组（P＜0.05）。随着大黄素添加水平的提高，ApoA1、GAPDH、HSP70、GPx1和GST的mRNA相对表达量均呈先升高后降低的趋势，且均在添加量为30mg/kg时相对表达量最高;30 mg/kg大黄素添加组糖代谢蛋白Aldh8a1、Eno3、Pgk1，能量代谢蛋白ETFA，氨基酸代谢蛋白FTCD的mRNA表达量均显著高于对照组（P＜0.05），而糖代谢蛋白Sord，氨基酸代谢蛋白FAH，核苷酸代谢蛋白EEF2b的表达量显著低于对照组(P＜0.05)。
　　综合以上所有结果可以表明，饲料中添加30 mg/kg大黄素能够通过复杂的调控网络提高团头鲂的代谢、免疫及抗氧化性能。

目录

声明

摘要

符号及缩略语中英文对照

第一章 文献综述

1 差异蛋白质组学研究现状

1．1 蛋白质组学概念

1．2 蛋白质组学研究主要技术体系

1．3 蛋白质组学在水产动物研究中的应用现状

2 差异蛋白质互作网络分析及表达量验证

2．1 差异蛋白质互作网络模型的构建

2．2 差异蛋白质表达量的验证

3 中草药及大黄素在水产养殖中的应用

3．1 中草药概况

3．2 中草药的种类及有效成分

3．3 中草药添加剂的作用机理

3．4 大黄素在水产养殖中的应用现状及展望

4 研究目的意义及技术路线

4．1 目的意义

4．2 技术路线

第二章 日粮添加大黄素的团头鲂肝脏差异蛋白质组分析

1 材料与方法

1．1 养殖实验

1．2 蛋白质组学分析

2 结果与分析

2．1 日粮添加大黄素的团头鲂肝脏2-DE图谱

2．2 日粮添加大黄素的团头鲂肝脏差异表达蛋白鉴定结果

2．3 日粮添加大黄素的团头鲂肝脏差异表达蛋白分类

2．4 日粮添加大黄素的团头鲂肝脏差异蛋白相对表达量变化

3 讨论

3．1 蛋白质分离技术对分离结果的影响

3．2 大黄素对团头鲂肝脏差异蛋白表达的影响

4 小结

第三章 差异表达蛋白的互作网络分析及基因功能注释

1 材料方法

1．1 差异表达蛋白互作关系分析

1．2 差异表达蛋白基因GO功能注释

2 结果分析

2．1 差异表达蛋白的网络互作关系

2．2 差异表达蛋白的GO基因功能注释

3 讨论

4 小结

第四章 差异表达蛋白的转录水平表达量验证及功能分析

1 材料方法

1．1 引物设计及合成

1．2 总RNA提取

1．3 总RNA纯化及cDNA制备

1．4 标准曲线及RT-PCR反应

1．5 数据分析

2 结果分析

2．1 大黄素对团头鲂肝脏抗氧化相关差异蛋白mRNA表达量的影响

2．2 大黄素对团头鲂肝脏其他差异蛋白mRNA相对表达量的影响

2．3 差异表达蛋白在蛋白水平及转录水平的相对表达量对比

3 讨论

3．1 蛋白水平与转录水平表达量的相关性

3．2 大黄素对团头鲂肝脏差异表达蛋白的功能影响

4 小结

全文结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间参加的学术会议及发表的学术论文