山核桃贮藏过程中类脂褐素形成机理研究

摘要

类脂褐素又称年龄色素，主要来源于氧化应激、活性羰基或者还原糖（及非酶糖基化过程中产生的化合物）与含氮生物大分子交联聚集的终末产物。类脂褐素在生物细胞中的积累会影响细胞功能，促进细胞衰老;黄褐色的类脂褐素在食品原料、加工贮藏过程中的积累会影响食品外观色泽，并且类脂褐素形成过程往往导致蛋白质侧链氨基酸的修饰，因此导致食品营养价值降低（如氨基酸生物利用度）。另外食物中积累的类脂褐素经人体摄入会诱发各种慢性疾病的发生。本研究以类脂褐素为对象，探索了山核桃原料贮藏过程中类脂褐素的积累。采用模拟反应揭示类脂褐素的形成机理和产物特性。研究结果为类脂褐素在真实体系中的积累提供一定的借鉴和参考，并为类脂褐素更深入的研究提供科学依据和奠定一定的理论基础。主要结果分述如下:
　　1.不同因素对富含油脂和蛋白的山核桃贮藏过程中类脂褐素积累的影响
　　(1)探讨了不同初始含水量(4％，6％，12％，16％)对采后山核桃贮藏过程中生理生化变化及类脂褐素积累的影响，发现水分含量是影响细胞生理生化代谢和类脂褐素积累途径的重要因素:高含水量（12％和16％）的山核桃贮藏过程中类脂褐素的积累主要通过糖基化途径，而低含水量（4％和6％）的山核桃贮藏过程中类脂褐素的积累主要通过脂质氧化途径;初始含水量低的山核桃(4％-6％)类脂褐素的积累与脂质氧化产物呈现高度正相关;初始含水量高的山核桃(12％-16％)脂质氧化不明显，而发生可溶性糖含量降低，还原糖含量增加，类脂褐素积累与糖基化进程密切相关，并与糖基化反应中间产物（HMF）呈现高度正相关。另外随着贮藏时间的延长和类脂褐素的积累，抗氧化物质和抗氧化能力呈现下降趋势。
　　(2)研究了三种包装方式（充氮气、真空和充氧包装）结合三个贮藏温度(10℃、25℃和40℃)对山核桃类脂褐素积累及老化劣变影响。结果表明，贮藏温度、包装方式也是影响山核桃脂质氧化、类脂褐素积累和老化劣变的主要原因:低温下充氮气及真空包装均能很好地抑制山核桃脂质氧化、抗氧化物质降低和类脂褐素的积累;高温和高氧环境能显著促进山核桃品质劣变和类脂褐素的积累。且方差分析的结果表明，温度对油脂氧化及类脂褐素积累的影响远高于包装方式。细胞超微结构实验发现，随着山核桃氧化程度的增加，出现明显的蛋白体融合的现象。琼脂糖电泳发现高度氧化的山核桃果肉基因组DNA完整性丧失，并通过AFLP实验发现高度氧化的山核桃果肉DNA多态性条带大量丢失。
　　(3)通过多种活性氧（O2·-、H2O2、·OH）和金属离子(Fe2+、Cu2+)处理山核桃油脂及山核桃匀浆液，探讨金属离子和活性氧对山核桃油脂氧化及类脂褐素积累的影响。结果显示，活性氧和金属离子均能促进山核桃油脂氧化和类脂褐素的积累:活性氧能促进脂质氧化初级产物积累，而对次级氧化产物促进作用不是很显著;而金属离子能极大程度地促进脂质氧化初级和次级产物的积累。脂质氧化产物是类脂褐素形成的重要前体物质，对山核桃油脂氧化挥发性产物的GC-MS分析发现主要是一些直链醛类化合物，有饱和醛、单不饱和醛和二烯醛等。另外，三种活性氧和两种金属离子也能加速山核桃粉末类脂褐素的积累。
　　2.分别采用山核桃中富含的多不饱和脂肪酸—亚油酸和山核桃油脂氧化产生的活性羰基与模式蛋白相互作用模拟类脂褐素形成过程，进一步揭示类脂褐素的形成机理和产物特性。模拟反应得到的反应机理与真实复杂的体系虽有一定的差距，但是可以为真实体系中类脂褐素的形成机理研究提供理论基础与有用的参考数据。
　　(1)通过氧化亚油酸与蛋白质(BSA)反应模拟类脂褐素形成。结果显示，随着油脂氧化进程的发生，蛋白质侧链被修饰，羰基值增加，并有典型的类脂褐素荧光峰出现，产物褐变程度加深。通过内源荧光最大波长的蓝移、硫磺素T荧光值增加、刚果红吸收结合圆二色光谱分析表明，类脂褐素形成过程伴随蛋白质构象改变。另外，还原性SDS-PAGE分析结果表明，氧化油脂与蛋白质结合形成的类脂褐素分子量增大，并有抗蛋白酶酶解特性，且不同氧化时间的类脂褐素表现出不同的细胞毒性。
　　(2)探讨了MDA、庚烯醛、庚二烯醛与蛋白质(BSA)相互作用所形成类脂褐素的产物特性。结果显示三种活性羰基也在类脂褐素形成中扮演着重要的角色:三种活性羰基化合物均能导致蛋白侧链赖氨酸和精氨酸的修饰、蛋白质构象改变和有色、荧光性类脂褐素的出现。其中由MDA所形成的类脂褐素荧光强度较高，其他两种活性羰基化合物所形成的类脂褐素的荧光强度则低很多。MDA所形成的类脂褐素在290、400nm紫外-可见吸光值增加，而庚烯醛和庚二烯醛所形成的类脂褐素在280和300-350nm吸光值增加。电泳结果分析表明三种活性羰基均能导致高分子量类脂褐素形成，并以MDA的作用更显著。

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摘要

缩略词

第一章 文献综述

1 类脂褐素概述

1．1 类脂褐素发现及发展

1．2 类脂褐素的形成途径及内外因对其积累的影响

1．3 类脂褐素在生物细胞中积累的部位

1．4 类脂褐素在生物细胞中积累的负作用

1．5 类脂褐素在食品加工贮藏过程中积累

1．6 类脂褐素产物特性、提取及检测方法

2 立题背景及主要研究内容

2．1 立题背景

2．2 主要研究内容

第二章 初始含水量对山核桃类脂褐素积累的影响

1 材料与方法

1．1 材料及处理

1．2 实验方法

1．3 数据处理

2 结果与分析

2．1 脂质氧化产物的积累

2．2 可溶性糖，还原糖和羟甲基糠醛的含量

2．3 类脂褐素的积累

2．4 脂氧合酶和酸性磷酸酶的活性变化

2．5 抗氧化物质和抗氧化能力的变化

2．6 类脂褐素形成与其他指标的相关性

3 讨论

4 本章小结

第三章 温度和包装方式对山核桃老化劣变及类脂褐素积累的影响

1 材料与方法

1．1 材料及处理

1．2 实验方法

1．3 数据处理

2 结果与分析

2．1 温度和包装方式对山核桃油脂氧化及抗氧化成分变化影响

2．2 温度和包装方式对山核桃细胞膜透性的影响

2．3 温度和包装方式对山核桃可溶性蛋白的影响

2．4 温度和包装方式对山核桃类脂褐素积累的影响

2．5 温度和包装方式对山核桃果肉表面色泽变化影响

2．6 温度和包装方式对山核桃超微结构的影响

2．7 温度和包装方式对山核桃基因组DNA的影响

3 讨论

4 本章小结

第四章 金属离子与活性氧对山核桃油脂氧化及类脂褐素积累的影响

1 材料与方法

1．1 材料及处理

1．2 实验方法

1．3 数据处理

2 结果与分析

2．1 金属离子对山核桃油脂氧化及挥发性氧化产物的影响

2．2 活性氧、金属离子对山核桃果肉匀浆液LFLP积累的影响

3 讨论

4 本章小结

第五章 不饱和脂肪酸诱导蛋白质氧化损伤和类脂褐素形成机理

1 材料与方法

1．1 材料及处理

1．2 实验方法

1．3 数据处理

2 结果与分析

2．1 油脂氧化进程

2．2 蛋白质侧链基团氧化修饰

2．3 荧光性类脂褐素、吡咯及褐色产物形成

2．4 蛋白质氧化形成类脂褐素过程中构象变化及聚集体分析

2．5 蛋白质氧化形成的类脂褐素细胞毒性分析

3 讨论

4 本章小结

第六章 蛋白质与活性羰基相互作用和类脂褐素的形成

1 材料与方法

1．1 材料及处理

1．2 实验方法

1．3 数据处理

2 结果与分析

2．1 蛋白质-活性羰基形成类脂褐素时侧链修饰

2．2 活性羰基-蛋白质作用与类脂褐素形成

2．3 活性羰基-蛋白质作用产生类脂褐素构象及分子量变化

2．4 活性羰基-蛋白质作用产生的类脂褐素色泽及光谱学特征

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文结论

论文创新点

致谢

攻读博士期间发表的论文