日粮淀粉直支链比例对生长猪肠道菌群结构与发酵功能的影响

摘要

成年动物每克肠道内容物中微生物总量高达1011-12个，肠道微生物及其代谢产物在膳食与宿主之间起到重要的桥梁作用。淀粉是动物饲料中能量的主要来源，也是肠道微生物主要的碳水化合物来源。根据结构，淀粉可分为直链淀粉和支链淀粉，天然淀粉是直链和支链淀粉一定比例的混合物。直链含量高的淀粉结构致密，在动物小肠不易被消化，进入后肠经微生物厌氧发酵，产生短链脂肪酸(Short chain fattyacids，SCFAs)和气体。SCFAs不仅是机体能量的重要来源，也是体内重要的信号分子，短链脂肪酸受体GPR41和GPR43的发现，为短链脂肪酸作用机制的阐明提供了依据。饲喂不同直支链比例淀粉日粮对生长猪粪便菌群结构有何影响？不同结构菌群体外发酵特性有何不同？不同直支链比例淀粉日粮对猪肠道SCFA的产生及GPR41和GPR43 mRNA表达有何影响？为回答上述问题，本研究以55日龄生长猪为研究对象，分别饲喂不同直支链比例淀粉日粮，研究不同直支链比例淀粉日粮对猪后肠产SCFA及GPR41和GPR43 mRNA表达影响;并通过体外发酵试验，研究饲喂不同直支链比例淀粉日粮的生长猪粪便微生物体外发酵特性及体外发酵过程中菌群结构的变化。
　　1.日粮淀粉直支链比例对生长猪粪便菌群体外发酵特性的影响
　　本研究的接种物来源于分别饲喂含高（直支比0.97，H组）、低（直支比0.26，L组）直支链比例淀粉日粮25天后的生长猪粪便，分别对不同直支比日粮进行体外发酵，以研究日粮淀粉直支比对生长猪粪便菌群体外发酵特性的影响。结果表明:接种物相同时，低直支比淀粉日粮体外发酵的累积产气量和最大产气速率(Rmax)极显著高于高直支比淀粉(P＜0.001);12h、24 h每g底物发酵产总挥发性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸及丁酸/总酸水平表现为:低直支比淀粉日粮＞高直支比淀粉日粮（P＜0.001），乙酸/总酸表现为:低直支比淀粉日粮＜高直支比淀粉日粮(P＜0.001)。说明:低直支比淀粉可发酵性强，发酵迅速，发酵产SCFA及气体量大。底物相同时，H组生长猪粪便菌群体外发酵的Rmax极显著高于L组菌群(P＜0.001);12h、24 h每g底物发酵产TVFA、乙酸、丙酸、丁酸及丁酸/总酸水平表现为:H组菌群＞L组菌群(P＜0.05)，乙酸/总酸表现为:H组菌群＜L组菌群（P＜0.001）;接种物菌群差异也导致了乳酸水平的不同，L组菌群在发酵过程中，发酵液中乳酸浓度先升高后降低;H组菌群在发酵过程中，发酵液中乳酸水平持续降低。揭示，日粮淀粉直支比显著影响生长猪粪便菌群发酵力，高直支比淀粉可提高粪便菌群发酵力，代谢产生更多SCFA。随着体外发酵时间的延长，总挥发性脂肪酸和各酸水平均逐渐升高，但乙酸占总酸比例逐渐降低，丁酸占总酸比呈上升趋势，提示发酵过程中可能存在乙酸到丁酸的转化。
　　2.日粮淀粉直支链比例对体外发酵过程中生长猪粪便菌群结构的影响
　　通过变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）和Real-time PCR技术，对体外发酵不同时间点的菌群结构和数目进行分析。DGGE图谱相似性分析显示，接种物相同的图谱归于同一大簇;在相同接种物形成的大簇内，又因发酵底物（不同直支比淀粉）形成不同的亚簇。DGGE图谱多样性分析显示，饲喂高直支比淀粉日粮生长猪粪便菌群多样性水平更高。
　　Real-time PCR结果显示，饲喂高直支比淀粉日粮生长猪的双歧杆菌、乳杆菌和拟杆菌门数量显著升高(P＜0.05)，总菌和厚壁菌门数量差异不显著。底物相同接种物不同，发酵12h时，乳杆菌和双歧杆菌数目H组＞L组（P＜0.05），拟杆菌门数量呈现H组＞L组的趋势(P=0.071);发酵24 h，乳杆菌数目H组＞L组(P＜0.05)。接种物相同底物不同，发酵12h，总菌、厚壁菌门、拟杆菌门、乳杆菌和双歧杆菌数目均无显著差异;发酵24 h，发酵液中乳杆菌和双歧杆菌数量表现为:低直支比淀粉日粮＞高直支淀粉日粮（P＜0.05）;发酵72 h，双歧杆菌数目低直支比淀粉日粮＞高直支淀粉日粮(P＜0.05)，总菌、厚壁菌门、拟杆菌门和乳杆菌数量差异不显著。提示，日粮淀粉直支链比例可能通过改变生长猪肠道中乳杆菌和双歧杆菌数量影响其菌群结构，从而影响菌群的体外发酵特性。
　　3.日粮淀粉直支链比例对生长猪肠道SCFA及组织GPR41和GPR43mRNA水平的影响
　　SCFAs是机体能量的重要来源，也是体内重要的信号分子，在众多生理过程中，发挥重要的调控作用。是否可以通过改变日粮淀粉直支链比例，调控肠道SCFA产生，从而影响组织中GPR41和GPR43的表达，是值得探讨的营养调控措施。因此，本章试验选用11头55 d杜长大三元杂交生长猪，随机分为两组，分别饲喂淀粉直支链比例不同的日粮，高直支比淀粉日粮组（H组，直支比0.97）和低直支比淀粉日粮组（L组，直支比0.26）。于试验期第0、7、14、21和28天采集粪便样品，第24、26天分别采集血液样品，28天屠宰取样。结果显示:H组生长猪的平均日增重(ADG)、结肠和盲肠食糜的pH均显著低于L组生长猪(P＜0.05);而H组生长猪结肠食糜TVFA、乙酸和戊酸水平显著高于L组(P＜0.05)，丁酸浓度呈现高于L组的趋势(P=0.082);采食后5h，两组生长猪血浆中TVFA、乙酸、丙酸和丁酸水平差异显著(P＜0.05)，表现为H组＞L组;而生长猪采食后2h血糖水平两组间差异不显著。90日龄生长猪GPR41 mRNA在脾脏和回肠中的表达量较高;GPR43 mRNA在脾脏中高度表达，脂肪组织、回肠和结肠中也检测到较高水平的表达;但日粮淀粉直支比的改变未引起各组织内GPR41和GPR43 mRNA水平的显著差异(P＞0.05)。

目录

声明

摘要

缩略语

引言

第一章 文献综述

1．淀粉

1．1 淀粉的结构和特性

1．2 抗性淀粉的分类与特性

1．3 常见饲料原料中的抗性淀粉

1．4 淀粉在猪肠道内的消化

2．淀粉的微生物降解产物短链脂肪酸

2．1 短链脂肪酸的生理作用

2．2 短链脂肪酸受体GPR41和GPR43

3．淀粉对后肠菌群的影响

3．1 肠道中淀粉降解菌的种类

3．2 淀粉摄入对肠道菌群的影响

4．总结

参考文献

第二章 日粮淀粉直支链比例对生长猪粪便菌群体外发酵特性的影响

1．材料与方法

1．1 直链和支链淀粉的测定

1．2 试验动物和饲养管理

1．3 动物试验设计和日粮

1．4 体外发酵试验设计及样品采集

1．5 发酵液挥发性脂肪酸(VFA)浓度测定

1．6 发酵液乳酸浓度测定

1．7 数据处理与分析

2．结果与分析

2．1 日粮淀粉直支比对生长猪粪便菌群体外发酵产气特性的影响

2．2 日粮淀粉直支比对生长猪粪便菌群体外SCFA产量的影响

2．3 日粮淀粉直支比对生长猪粪便菌群体外乳酸产量的影响

3．讨论

3．1 不同直支比淀粉的体外发酵特征分析

3．2 日粮淀粉直支比对猪肠道菌群发酵特征的影响分析

4．小结

参考文献

第三章 日粮淀粉直支链比例对体外发酵过程中生长猪粪便菌群结构的影响

1．材料方法

1．1 试验设计

1．2 体外发酵及样品采集

1．3 发酵液总DNA提取及PCR扩增

1．4 DGGE及图谱分析

1．5 Real-time PCR分析发酵液中微生物菌群

2．结果与分析

2．1 日粮淀粉直支比对体外发酵过程中粪便菌群影响的DGGE分析

2．2 日粮淀粉直支比对体外发酵过程中生长猪粪便菌群影响的Real-Time PCR分析

3．讨论

4．小结

参考文献

第四章 日粮淀粉直支链比例对生长猪肠道SCFA及组织GPR41和GPR43 mRNA水平的影响

1．材料与方法

1．1 试验动物、日粮及试验设计

1．2 样品采集

1．3 气相色谱(GC)测定粪便和食糜SCFA水平

1．4 血浆SCFA和葡萄糖水平测定

1．5 RNA提取

1．6 RT-PCR

1．7 GPR41和GPR43质粒构建和Real-time PCR

1．8 数据处理与分析

2．结果与分析

2．1 日粮淀粉直支比对生长猪生长性能及肠道pH影响

2．2 日粮淀粉直支比对生长猪肠道SCFA水平的影响

2．3 日粮淀粉直支比对生长猪血浆SCFA水平及血糖浓度的影响

2．4 日粮淀粉直支比对90日龄生长猪GPR41和GPR43组织表达水平的影响

3．讨论

4．小结

参考文献

全文结论

致谢

附录