栗树林土壤微生物宏基因组文库中新型酯酶的功能筛选及其鉴定分析

摘要

羧酸酯水解酶，主要催化酯类化合物的水解反应和合成反应。脂肪酶和酯酶是脂解酶的两个主要的家族。在某些条件恶劣的工业生产过程中，由于其固有的热稳定性和耐有机溶剂的功能，并结合其较高的化学选择性，区域选择性和对映体选择性，使酯类水解酶在各种工业应用中成为了非常有吸引力的生物催化剂。同时，从极端微生物来源的酶还可能拥有一些额外的功能，例如在极高或极低的温度，极端的pH值或高盐度的水平下活动，这一点可能引起某些有特定目的的产业的兴趣。其中，酯酶主要发现于植物、动物和微生物中，并且大多数工业酯酶都来源于微生物。同时，酯酶是非常经济、高效的生物催化剂，在食品工业包括营养改善、风味形成及食品发酵中有着广泛应用。
　　依靠传统方法，新的脂肪酶和酯酶是通过分离产生酯解活性的微生物纯培养菌株发现的。而进入基因组时代，基因组项目使基因挖掘成为可能，利用与已知的脂肪酶和酯酶的同源性，就可搜索新型酯解酶。宏基因组时代的来临更意味着基因组这一领域宏基因组的研究向前迈进了一大步，宏基因组即指某一环境中微生物群落所有基因组的集合。目前，分子生物学技术已经可以用来构建环境总DNA库，包括不可培养微生物的基因组，这为发现具有独特性质的、新颖的未知酶类的广阔领域打开了一个新的窗口。另外，可以用宏基因组文库进行功能筛选，检测具有酯解活性的克隆。这种筛选方式的成功依赖于所克隆基因与异源宿主的转录翻译元件是否具有兼容性，通常会选用大肠杆菌作为此类宿主。
　　在本研究中，本实验室采集来源于我国云南栗树林地区的土壤样品，并成功构建了一个高质量的宏基因组科斯质粒文库。通过利用该文库进行功能筛选，发现了两个新型酯酶EstGX1和EstGX2。多序列比对及进化树分析表明，这两个预测蛋白酶均为微生物脂类水解酶第Ⅳ家族的新成员。聚丙烯酰胺蛋白胶分析表明纯化后的EstGX1和EstGX2几乎显示为一条带，它们的分子量大小与预测的分子量31kDa和33kDa相一致。随后，本实验对纯化酯酶EstGX2的生化特性进行分析，处理的相关酶学特性包括最适pH、最适温度以及该酶对有机溶剂和金属离子的耐受性。EstGX2的最适温度为50℃，最适pH为9.0。然而，在极酸和极碱(＞pH10.0)的条件下，该酯酶会失去对最适底物对硝基苯酚丁酸酯的水解能力。特别值得一提的是，EstGX2在99℃反应55分钟后仍能保持约40％的活性，且该酶在15％乙醇存在的体系中水解活性竟会有所提高。EstGX2的这些特性，包括在超高温中的稳定性以及在有机溶剂中的稳定性，可能使EstGX2成为食品工业中一个颇有潜力的候选酶。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 羧酸酯水解酶概述

1．1 羧酸酯酶简介

1．2 羧酸酯水解酶的分类

1．3 羧酸酯水解酶的立体结构

1．4 羧酸酯水解酶的催化机制

1．5 羧酸酯水解酶的特殊活性及其在工业中的应用

2 宏基因组学概论

2．1 宏基因组学的简单介绍

2．2 宏基因组文库的筛选方法

2．3 土壤宏基因组文库筛选新型酯解酶的国内外研究进展

3 本实验研究的技术路线

4 本实验研究的目的及意义

第二章 栗树林土壤宏基因组文库筛选新型羧酸酯酶基因

1 实验材料

1．1 样品来源

1．2 菌株与载体

1．3 培养基

1．4 酶及生化试剂

1．5 常用溶液配制

1．6 实验仪器

2 实验方法

2．1 栗树林土壤宏基因组文库羧酸酯酶的活性筛选

2．2 亚克隆产酯酶菌株的筛选

2．3 测序及序列分析

3 实验结果与分析

3．1 酯解酶活性克隆筛选及亚克隆

3．2 酯解酶活性亚克隆序列测定及分析

4 讨论

第三章 羧酸酯酶基因的原核异源表达

1 实验材料

1．1 菌株与载体

1．2 酶及生化试剂

1．3 常用溶液配制

1．4 实验仪器

2 实验方法

2．1 酯酶基因引物的设计与合成

2．2 酯酶基因的PCR扩增

2．3 克隆产物和表达载体的酶切及回收

2．4 重组表达载体的构建

2．5 E．coli BL21电转化感受态的制备及转化

2．6 酯酶重组子的筛选及鉴定

2．7 重组酯酶基因的诱导表达

2．8 重组酯酶的裂解及亲和层析纯化

2．9 重组酯酶的SDS-PAGE凝胶检测

2．10 Bradford试剂盒进行蛋白定量

3 实验结果与分析

3．1 酯酶基因的PCR扩增

3．2 克隆产物和表达载体的双酶切

3．3 酯酶重组子的鉴定

3．4 重组酯酶基因的诱导表达和亲和层析纯化

3．5 Bradford法测定EstGX2蛋白质量

4 讨论

第四章 重组羧酸酯酶EstGX2的酶学性质表征

1 实验材料

1．1 酶及化学试剂

1．2 常用溶液配制

1．3 实验仪器

2 实验方法

2．1 对硝基苯酚法测定酯酶活力的标准曲线

2．2 酯酶EstGX2的活力测定

2．3 酶促反应时间研究

2．4 EstGX2的底物特异性研究

2．5 EstGX2的动力学常数测定

2．6 不同温度对EstGX2活性及稳定性的影响

2．7 不同pH对EstGX2活性的影响

2．8 不同金属离子对EstGX2活性的影响

2．9 有机溶剂及表面活性剂对EstGX2酶活的影响

3 实验结果与分析

3．1 对硝基苯酚标准曲线

3．2 EstGX2的活力测定

3．3 EstGX2酶促反应时间的测定

3．4 EstGX2的底物特异性确定

3．5 EstGX2动力学常数的确定

3．6 EstGX2的最适温度及温度稳定性测定

3．7 EstGX2的最适pH测定

3．8 不同金属离子、有机溶剂及表面活性剂对EstGX2酶活影响的测定

4 讨论

总结与展望

1．总结

2．展望

参考文献

致谢

科研情况