组蛋白H3甲基转移酶EZH2、GLP在小鼠早期发育过程中的功能研究

摘要

表观遗传学是指可以在生命体世代间传递且不符合传统孟德尔遗传规律的核内遗传方式，是功能基因组学研究的主要内容。表观遗传机制是哺乳动物正常发育和维持组织特异性基因表达模式所必需的。在哺乳动物发育过程中，有两个很重要的发育时期或者说是细胞类型:附植前的胚胎和原始生殖细胞（卵母细胞和精子的前体），在这个发育时期或细胞类型中表观基因组会经历很深刻的重编程，其中组蛋白的转录后修饰是近年来表观遗传修饰在附植前胚胎发育过程中的研究热点。核心组蛋白N-末端的转录后修饰包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化以及ADP-核糖基化，影响染色体组成从而来调节转录因子的获得和附近基因的转录活性。本论文选取了研究比较多、机制较清楚的组蛋白H3K27me3和H3K9me2修饰作为研究对象，对负责其催化的组蛋白甲基转移酶EZH2和GLP在早期胚胎发育中的作用进行了研究。
　　1.小鼠早期胚胎中EZH2的表达水平及功能研究
　　Ezh2对小鼠早期胚胎的发育至关重要。胚胎内Ezh2的表达不足会导致附植后的小鼠胚胎致死。Ezh2缺陷的胚胎显示出明显的生长潜力受损，Ezh2-/-胚胎干细胞(ES)系不能建成，细胞呈现粘附生长和滋养层细胞向巨噬细胞分化。本文研究中采用在体外受精液中加入新生蛋白合成抑制剂放线菌酮(Cycloheximide)处理或在小鼠受精后2小时的合子中显微注射Ezh2 siRNA，来抑制或敲低合子或胚胎中Ezh2的表达，并观察EZH2在小鼠早期胚胎发育过程中的表达模式及Ezh2的不足对其胚胎发育的影响。收集卵子及受精的合子采用免疫荧光染色法检测，结果显示EZH2在卵子中定位很弱或几乎检测不到，而在受精的合子中EZH2在细胞核上的定位很强;Cycloheximide处理的受精合子中，Westernblot和免疫荧光染色检测结果显示EZH2蛋白的表达量在处理组中显著低于对照组，结果呈现出Cycloheximide处理抑制了受精卵中的EZH2蛋白的新生合成，这表明EZH2蛋白质在受精后需要新生合成。另外，采用特异敲低Ezh2的方法，挑选出体外受精2小时的合子并显微注射Ezh2 siRNA来特异敲低母源及受精过程新合成的Ezh2的表达，然后常规方法正常体外培养并观察胚胎的发育，在胚胎发育的各个时段显微镜下观察并计数，结果发现Ezh2不足的胚胎体外发育迟缓严重，囊胚的形成率降低。由Ezh2敲低的合子发育而来的囊胚，qPCR检测结果显示:多潜能标记基因Oct4，Sox2和Nanog的表达水平呈现出显著下降。此外，在Ezh2缺乏的囊胚中，与胚胎胚层分化有关的基因，包括Gata6，Hoxb1和Hand1的表达水平升高。另外，在Ezh2敲低的囊胚中，TUNEL检测结果显示内细胞团内细胞的凋亡数目显著增加。在Ezh2 siRNA的胚胎中，组蛋白H3K27me2/3的修饰水平显著下降。我们的结论是Ezh2在附植前胚胎的发育中是必不可少的，通过调控表观遗传修饰和细胞凋亡从而影响早期胚胎的发育。
　　2.小鼠早期胚胎中GLP的表达水平及功能研究
　　G9A相似蛋白GLP在小鼠早期胚胎发育中起着非常重要的作用。GLP不足的胚胎呈现出严重的发育迟缓和致死在约胚胎9.5天。本文，首先收集卵子、受精的合子及体外培养的胚胎采用免疫荧光染色及westernblot方法检测，观察并分析了GLP在卵子及早期胚胎中的表达模式及表达水平。另外，在体外受精2小时的受精合子中采用特异敲低母源及父源Glp达的思路显微注射Glp siRNA，然后常规方法正常体外培养并观察胚胎的发育，在胚胎发育的各个时段显微镜下观察并计数，分析Glp不足的胚胎在体外培养中的发育情况。结果表明:敲低Glp的表达会导致胚胎发育异常，降低囊胚的形成率，且使多潜能标志基因Oct4，Sox2和Nanog的表达水平也显著下降。孵化囊胚继续体外培养发现，Glp不足的胚胎内细胞团多潜能受损，不能分化形成类ES细胞样细胞。TUNEL及Caspase3/7试剂盒检测结果显示Glp敲低的囊胚胚胎中细胞的凋亡率显著升高，激活的Caspase3/7较多。另外，两个促凋亡的基因Caspase3/9的表达水平显著升高。进一步检测发现，在Glp敲低的胚胎中H3K9me2的修饰水平显著下降。总之，我们的研究结果表明Glp在小鼠早期胚胎发育过程中参与H3K9me2修饰的调节和维持胚胎正常的发育所必须的。
　　本实验对组蛋白甲基转移酶EZH2、GLP在小鼠早期胚胎发育过程中的作用进行了详细的研究，发现EZH2、GLP在维持胚胎正常发育都是必需的。EZH2或GLP的表达不足都致使胚胎发育缺陷，胚胎的多潜能性受损，靶组蛋白的甲基化修饰水平发生变化。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语的中英文对

第一篇 文献综述

第一章 组蛋白甲基转移酶EZH2和H3K27甲基化修饰的研究综述

1 组蛋白的共价修饰及其功能作用

2 哺乳动物合子中的表观遗传修饰

3 PCG蛋白复合体的组成及功能作用

4 PRC1和PRC2复合物的组成

5 PRC2的亚单位及其功能作用

6 EZH2与X染色体失活有关

7 EZH2和H3甲基化在发育中的作用

第二章 组蛋白甲基转移酶GLP和H3K9甲基化修饰的研究综述

1 G9A和GLP两个组蛋白甲基转移酶

2 H3K9甲基化及其功能作用

3 GLP的功能

4 G9A／GLP与PRC2的相互作用

5 研究目的和意义

第二篇 试验部分

第一章 EZH2在小鼠早期胚胎发育中的作用及参与催化H3K27甲基化

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

第二章 GLP在小鼠早期胚胎发育中的作用及催化H3K9甲基化修饰

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

参考文献

全文结论

全文创新

附录

致谢

攻读博士期间发表的论文