应用LAMP检测技术快速诊断大豆根茎部真菌病害

摘要

大豆是原产于我国的一年生的草本植物，现在世界各地都有栽培。大豆也是一种多病害植物，大豆根茎部病害是影响大豆产量和品质的重要因素之一，其分布广泛、病原菌种类复杂，危害严重，较难防治。特别是感病初期，症状相似度极高，不易区分。传统的诊断方法费力、耗时长，且容易造成误诊，不利于及时指导防治。所以急需要开发一些新技术对引起大豆根部病害的不同病原菌进行快速检测。目前对植物病原菌的分子检测需将田间采集的病害样本带回实验室用PCR仪来完成，耗时长，难以达到在田间现场对植物病害进行快速诊断的需求，不利于对病害进行指导及时防治。本试验研发了一套简便，快速，安全，且检测成本低能在田间现场快速诊断病害的LAMP方法，为实行田间现场快速诊断病害提供了必要的技术支持。
　　1.应用本实验室研发的分别针对尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)、茄腐镰孢菌(Fusarium solani)、层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)、木贼镰孢菌(Fusariumequiseti)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)的7个LAMP检测体系对从江苏省、安徽省、湖北省和云南省采集的640份病害样本进行快速病害诊断。LAMP检测阳性率分别为:20％、27％、12％、7％、4％、10％和13％;安徽省和江苏省复合侵染情况比较严重，占检测阳性率31％，其中由两种病原菌侵染的病害样本和由三种病原菌侵染的病害样本分别为6％、24％，尖镰孢菌和茄腐镰孢菌为该地区的优势种，其次为层出镰孢菌和木赋镰孢菌。采用LAMP检测技术在实验室内完成病害诊断仅需1.5～2 h，与传统诊断、普通分子技术诊断相比较，该技术简便，快速，安全，检测成本低。在农业生产上十分有利于对病害进行指导及时防治。
　　2.本试验根据LAMP检测技术在恒温条件下进行反应这一特点，通过反复探索设计了一套简易的，实用的用保温杯来替代PCR仪提供恒温（或近恒温）条件下完成LAMP反应的操作方法。试验结果表明:用保温杯替代PCR仪提供恒温（或近恒温）条件完成的LAMP检测灵敏度能达到LAMP检测灵敏度的要求，证明该方法可以应用到实际的病害快速诊断中。本试验还建立了一套简便，快速，安全，检测成本低的操作程序方案2-1b，具有不需要特殊仪器、可视化判断结果和可应用于植物病害田间现场快速诊断的优势，适合基层单位和检验检疫机构开展分子检测和病害诊断。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 引起大豆根腐病的病原真菌

1．1 尖镰孢菌

1．2 禾谷镰孢菌

1．3 层出镰孢菌

1．4 茄腐镰孢菌

1．5 木贼镰孢菌

1．6 立枯丝核菌

1．7 菜豆壳球孢菌

2 大豆真菌病害的诊断技术

2．1 传统的检测方法

2．2 免疫学法

2．3 分子技术

参考文献

第二章 LAMP检测对七种病原菌引起的大豆根部病害的快速诊断应用

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 大豆根部病害的症状

2．2 LAMP检测结果与分析

3 讨论

参考文献

第三章 应用LAMP检测在田间快速诊断大豆真菌病害的技术方法改进

第一节 保温杯替代PCR仪完成LAMP反应

1 材料与方法

2 结果

第二节 适用于田间现场快速诊断大豆真菌病害的LAMP检测操作程序的改进

1 LAMP检测操作中加入试剂步骤的初步简化方案

2 LAMP检测操作中加入试剂步骤的3种初步简化方案结果

3 对方案2进一步改进的试验

4 对方案2进一步改进的试验结果

5 方案2-1b的适用性验证

6 方案2-1b的适用性验证结果

参考文献

致谢