大螟两个气味结合蛋白基因的体外表达及配体结合能力分析

摘要

在漫长的进化过程中，昆虫特别是蛾类昆虫形成了高度灵敏的嗅觉系统，并以此感受外界环境中各种气味物质，从而做出相应的生理或行为反应，如寻找配偶、栖息场所以及躲避天敌等。触角是昆虫最重要的嗅觉器官，蛾类昆虫的触角高度发达，着生有大量的嗅觉感器。在昆虫的外周神经系统，嗅觉的完成依赖于嗅觉感器内的多种蛋白，其中气味结合蛋白(Odorant Binding Protein，OBP)高浓度存在于嗅觉感器的腔内，其功能被认为是结合并运送脂溶性气味物质穿过感器腔到达感受神经元膜嗅觉受体(Odorant Receptor, OR)部位，然后气味分子激活嗅觉受体。研究重要农业害虫的OBP及其功能，不仅有助于深入理解昆虫的嗅觉机制，还能为开发基于嗅觉的害虫行为调控技术提供潜在靶标。大螟Sesamia inferens属鳞翅目夜蛾科，是水稻上的重要害虫。为了探讨大螟的嗅觉机制，本研究在课题组前期有关基因鉴定和组织表达谱分析的基础上，选取2个触角高表达的OBP基因进行原核表达，然后利用荧光竞争结合试验，测定了2个OBP和不同植物气味的结合能力，主要结果如下:
　　1.大螟OBP15的原核表达及配体结合能力的分析
　　大螟OBP15基因在触角中高表达，推测在嗅觉中起作用。首先利用原核表达系统对该基因进行体外表达和纯化:把OBP基因构建到pET-30a(+)载体中，把正确的重组质粒转入大肠杆菌感受态中，用终浓度为1 mM的IPTG进行诱导表达6h，经SDS-PAGE检测发现该重组蛋白主要在大肠杆菌的包涵体中表达。经过蛋白复性、肠激酶切和亲和层析纯化等过程，得到大小为14KD左右的目的纯化蛋白。得到纯化蛋白后，用1-NPN作为荧光探针，利用荧光竞争结合分析的方法，测定了大螟OBP15对35种水稻气味物质的结合能力。结果发现，OBP15纯化蛋白对被测气味物质均没有明显的结合能力（Ki＞50μM），有待扩大气味物质的筛选范围，找到和OBP15有较强结合能力的气味物质。
　　2.大螟ABPX的原核表达及配体结合能力分析
　　触角结合蛋白(Antennal binding protein，ABP)隶属于OBP家族，其功能研究相对较少。课题组前期研究发现，大螟ABPx在成虫触角中高表达，本文利用体外技术对其功能进行了探索。首先利用原核表达系统在大肠杆菌中对该蛋白进行了大量表达和纯化，得到预期大小（14KD左右）的目的蛋白。然后以1-NPN位探针，利用荧光竞争结合试验的方法，测定了ABPx对35种不同结构的气味物质配体的结合能力。结果显示，在被测35种气味中，大螟ABPx只与β-紫罗兰酮有一定的结合能力(Ki=35.58μM)。由此推测该ABPx可能在大螟对β-紫罗兰酮的感受中起作用，但并不排除在未检测到的其他气味的感受中起作用。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 昆虫的嗅觉感器及嗅觉感受机制

2 昆虫气味结合蛋白的研究进展

2．1 气味结合蛋白类型和分子结构

2．2 气味结合蛋白在昆虫的组织分布及其功能

2．3 昆虫气味结合蛋白体外配体结合试验

3 大螟及其发生，为害和防治的研究

3．1 大螟的生物和生态学特征

3．2 大螟为害的特征

3．3 大螟的防治

4 本研究的目的和意义

第二章 大螟OBP15的原核表达及配体结合能力分析

1 材料和方法

1．1 供试昆虫和组织收集

1．2 主要仪器和设备

1．3 大螟总RAN的提取

1．4 cDNA的合成

1．5 引物设计及PCR扩增

1．6 PCR产物纯化连接转化和测序

1．7 大螟OBP15原核表达载体的构建

1．8 大螟OBP15重组质粒的诱导表达

1．9 大螟OBP15的纯化

1．10 大螟OBP15蛋白的SDS-PAGE胶电泳检测

1．11 大螟OBP15蛋白的荧光竞争结合试验

2 结果与分析

2．1 大螟OBP15原核表达载体的构建和鉴定

2．2 大螟OBP15的重组质粒在大肠杆菌中的表达和纯化

2．3 1-NPN与大螟OBPl5的结合曲线的测定

2．4 SinfOBPl5与气味物质结合能力的测定

3 讨论

第三章 大螟ABPX的原核表达及配体结合能力分析

1 材料和方法

1．1 供试昆虫和组织收集

1．2 主要仪器和设备

1．3 大螟总RNA提取

1．4 cDNA合成

1．5 引物设计及PCR扩增

1．6 PCR产物纯化连接转化和测序

1．7 大螟ABPx表达载体的构建

1．8 大螟ABPx重组质粒的诱导表达

1．9 大螟ABPx的纯化

1．10 大螟ABPx蛋白的SDS-PAGE胶电泳检测

1．11 大螟ABPx蛋白的荧光竞争结合试验

2 结果与分析

2．1 大螟ABPx原核表达载体的构建和鉴定

2．2 大螟ABPx的重组质粒在大肠杆菌中表达量、可溶性和纯化结果的分析

2．3 1-NPN与大螟ABPx的结合曲线的测定

2．4 SinfABPx与气味物质结合能力的测定

3 讨论

全文总结

参考文献

附录：攻读硕士学位期间学术论文的发表情况

致谢