甜菜夜蛾气味结合蛋白的基因克隆、组织分布及配体结合能力分析

摘要

在长期的进化过程中，昆虫形成了高度灵敏的嗅觉系统，并以此来感受空气中的挥发性物质，寻找配偶、食物和栖息场所等。在昆虫的嗅觉过程中，气味结合蛋白(Odorant binding proteins，OBPs)起结合并运输气味物质到气味受体的作用，是嗅觉的第一个生化步骤。甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)是世界性重大农业害虫，对其OBP的研究，可以更好地指导行为调控技术在甜菜夜蛾防治中的应用，并为开发新型行为调控技术提供靶标。在课题组前期对甜菜夜蛾性信息素结合蛋白(Pheromone binding proteins，PBPs)及一般气味结合蛋白(General odorant bindingproteins，GOBPs)研究的基础上，本研究进一步利用甜菜夜蛾转录组数据，通过生物信息学和分子生物学相结合的方法，从甜菜夜蛾中发现另外8个OBP基因，测定了它们的组织表达谱，并利用荧光竞争结合实验初步探索了它们的生理功能。主要结果如下:
　　 ⑴甜菜夜蛾OBP的基因克隆及序列分析。结合转录组数据分析并利用RACE技术，克隆了甜菜夜蛾8个OBP的全长cDNA序列，分别命名为SexigOBP1、SexigOBP2、SexigOBP3、SexigOBP4、SexigOBP5、SexigOBP6、SexigOBP7和SexigABP2。序列分析表明，所有OBP均具有典型OBP的序列特征，包括6个保守的半胱氨酸位点，但SexigOBP2只有4个保守的半胱氨酸位点。SexigOBP1、SexigOBP2、SexigOBP4、SexigOBP5和SexigABP2的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫OBP具有很高的相似性，分别达88％、70％、82％、88％和72％。;SexigOBP3、SexigOBP6和SexigOBP7的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫OBP的相似性较低，分别为44％、54％和52％。
　　 ⑵甜菜夜蛾OBP基因在不同虫态及不同组织的表达量。组织表达谱分析及雌雄间差异比较是了解OBP基因功能的重要途经。为了明确SexigOBP基因的组织分布情况，本研究利用RT-qPCR技术检测了SexigOBP1、SexigOBP2、SexigOBP7和SexigABP2基因在幼虫、雌雄成虫不同组织的表达量。结果表明，在幼虫期，4个OBP主要在幼虫头部表达，以SexigOBP2基因的表达量最高，其次是SexigOBP1，而SexigOBP7和SexigABP2基因的表达量很低。在成虫期，SexigOBP7和SexigABP2主要在触角表达，在其他组织很少量或不表达;SexigOBP1和SexigOBP2基因在不同组织中都有不同程度的表达，特别是在足和翅中的表达量较高。SexigOBP基因在触角等化感组织中的表达，暗示其在甜菜夜蛾的嗅觉或味觉中起作用。
　　 ⑶甜菜夜蛾OBP的原核表达及蛋白纯化。鉴于SexigOBP1和SexigOBP2基因在幼虫期高表达，为了研究其在幼虫嗅觉中的功能，进一步对这2个基因以及SexigABP2基因进行了体外大量表达和纯化。将这3个基因构建到pET-30a(+)表达载体中，然后在大肠杆菌Escherichia coli中经IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表明，pET/SexigOBP1、pET/SexigOBP2和pET/SexigABP2分别在约19kDa、18kDa、22kDa处有一明显加粗条带。重组蛋白经镍离子亲和层析、肠激酶酶解等步骤纯化后，得到切除His标签的目的蛋白。
　　 ⑷甜菜夜蛾OBP的配体结合能力分析。利用荧光竞争结合实验测定了3个SexigOBP对不同气味物质的结合能力。结果表明，幼虫期高表达的SexigOBP1和SexigOBP2对带有羟基、羰基、酯基官能团的长碳链(≥8C)脂肪族类化合物具有较强的结合能力，推测SexigOBP1参与了幼虫对寄主植物挥发物β-丁香烯及苯乙酮等气味的感受;成虫期高表达的SexigABP2对不饱和长碳链化合物的结合能力较饱和短碳链化合物要强，可能参与了成虫对法尼醇等植物气味的感受。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1 甜菜夜蛾的发生与危害

2 信息化合物概述

2．1 昆虫信息素

2．2 植物挥发物对昆虫取食和产卵选择性的影响

3 嗅觉感器及嗅觉机制

4 昆虫气味结合蛋白的研究进展

4．1 昆虫气味结合蛋白的分子特征

4．2 昆虫气味结合蛋白的表达谱

4．3 昆虫气味结合蛋白在触角感器中的分布

4．4 昆虫气味结合蛋白的生理功能及研究进展

5 本项研究的目的和意义

第二章 甜菜夜蛾气味结合蛋白的基因克隆及序列分析

1 材料和方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂和仪器设备

1．3 昆虫总RNA的提取

1．4 PCR引物设计

1．5 RACE扩增

1．6 PCR产物纯化、连接、转化、测序和序列分析

2 结果与分析

2．1 甜菜夜蛾气味结合蛋白基因全长的cDNA克隆及序列分析

2．2 甜菜夜蛾气味结合蛋白的系统进化分析

3 讨论

第三章 甜菜夜蛾气味结合蛋白基因的表达谱研究

1 材料和方法

1．1 供试昆虫及组织收集

1．2 主要试剂和仪器设备

1．3 甜菜夜蛾不同组织的总RNA提取

1．4 cDNA第一链的合成

1．5 PCR引物设计

1．6 实时定量PCR反应

2 结果与分析

2．1 甜菜夜蛾幼虫组织中气味结合蛋白的表达量比较

2．2 甜菜夜蛾成虫不同组织中气味结合蛋白的表达量比较

3 讨论

第四章 甜菜夜蛾气味结合蛋白的原核表达及重组蛋白的纯化

1 材料和方法

1．1 供试昆虫及组织收集

1．2 主要试剂和仪器设备

1．3 昆虫总RNA的提取

1．4 cDNA第一链的合成

1．5 引物设计及PCR扩增

1．6 PCR产物纯化、连接、转化和测序

1．7 原核表达载体的构建

1．8 蛋白SexigOBPs的纯化

2 结果与分析

2．1 原核表达载体的构建和鉴定

2．2 重组质粒在大肠杆菌中表达及可溶性分析

3 讨论

第五章 甜菜夜蛾气味结合蛋白的配体结合能力分析

1 材料和方法

1．1 主要试剂和仪器设备

1．2 蛋白溶液和配体溶液的配制

1．3 荧光竞争性结合实验

2 结果与分析

2．1 1-NPN与甜菜夜蛾气味结合蛋白结合曲线的测定

2．2 SexigOBP1、SexigOBP2与气味物质结合能力的测定

2．3 SexigABP2与气味物质结合能力的测定

3 讨论

全文总结

参考文献

附录：攻读硕士学位期间学术论文的发表情况

致谢