产功能性油脂香榧内生真菌的筛选及其脂肪酸合成关键酶的克隆表达研究

摘要

随着生活水平的日益提高，人类对食物的保健功能日益重视，油脂是三大营养物质之一，发现新型功能性油脂，对其功能性成分进行研究，已成为改善人类健康状况的有效途径。香榧是一类古老珍稀树种，其种子有特殊香气，富含包括金松酸在内的多种具较强生理活性功能的不饱和脂肪酸，但因其生长缓慢，不能进行大规模采摘用于生产油脂。而内生真菌与宿主长期共存，可能存在着能与植物宿主的遗传信息相互交换的遗传系统，产生与宿主相同或相似的包括功能性油脂在内的代谢产物，可以作为微生物生产功能性油脂研究的重要来源。
　　本研究以产功能性油脂香榧内生真菌为对象，通过分析其生物多样性和油脂脂肪酸成分，证实了内生真菌可以产生和宿主相似的油脂成分，并在香榧内生真菌油脂中发现了金松酸等功能性脂肪酸;通过优化发酵条件实现了提高油脂产量的目的;对产功能性油脂香榧内生真菌脂肪酸合成关键酶——乙酰辅酶A羧化酶功能域基因进行克隆表达，证实羧基转移酶功能域是抑制剂的作用位点。研究从理论和实践结合，为香榧内生真菌产功能性油脂的实际应用奠定了良好的实验室基础。主要研究结果如下:
　　(1)进行了产油脂香榧内生真菌的分离鉴定及油脂含量测定。从14个野生香榧样品中分离得到106株内生真菌，用苏丹黑进行染色，发现47株菌可以产生油脂，分离自树龄最长的香榧中的XF-38菌株产生油脂含量最高，为17.68％。对其中15株产油脂量在7.5％以上的菌株进行形态及ITS序列测定比对，确定菌株分类学地位，并构建ITS亲缘关系树，发现15株菌分属于13属，亲缘性较低，而香榧产油脂能力和香榧树龄、树种及地域相关，最重要因素是树龄，树龄越长的香榧树能共生更多种类产油脂能力强的内生真菌，同一分离源中分离的内生真菌具较高的亲缘性。本研究分离源中树龄为500年以上的香榧树中共分离到7株产生油脂含量在7.5％以上的真菌，且7株菌的同源性较高。
　　(2)进行了产油脂香榧内生真菌菌株的脂肪酸及不皂化物的成分分析研究和特殊脂肪酸的提取实验。用气质联用色谱(GC-MS)对15株产油脂量在7.5％以上真菌的脂肪酸进行成分分析，并与香榧籽油进行比较，发现内生真菌株油脂中含香榧籽油中所有的10种脂肪酸，且每种脂肪酸所占比例和香榧籽油脂肪酸高度相似，其中不饱和脂肪酸占60％以上，特别是XF-38菌株产生的脂肪酸中，除油酸、亚油酸等常见脂肪酸外，还含具特殊活性功能的金松酸（5，11，14-二十碳三烯酸），其最高含量达脂肪酸总量7.11％，油脂多不饱和脂肪酸占总量的百分比达到33.30％;不皂化物成分分析结果表明，香榧内生真菌油脂的不皂化物含量在0.01％以下，成分有角鲨烯、麦角固醇和β-谷甾醇三种;脂肪酸及不皂化物的成分分析结果证明香榧内生真菌油脂具有作新型功能性油脂原料的研究和应用价值。最后，用硅胶柱层析和高效液相色谱(HPLC)相结合的方法对金松酸和亚油酸进行了成功的分离。
　　(3)内生真菌发酵产油脂量直接关系到金松酸等功能性油脂的产量，为提高香榧内生真菌的油脂产量和降低发酵成本，以金松酸等功能性油脂产量最高的XF-38菌株为实验对象，进行发酵条件的优化。得出最佳发酵条件为28℃、初始pH值为6.5，转速180 rpm，培养基中添加3.0％葡萄糖及0.5％酵母粉，在此条件下，油脂产量达到3.05 g/L;在培养60 h后在发酵液中补加1.5％葡萄糖，油脂产量可在12h后进一步提高至3.35 g/L，比未补加前增加9.8％;XF-38菌株能在以香榧叶、玉米秆为碳源的培养基中生长，用纤维素酶处理香榧叶后，油脂含量达2.01g/L，比酶处理前提高了23.8％。对最优发酵条件下XF-38菌株的金松酸含量进行测定，结果表明发酵条件对金松酸所占总脂肪酸质量百分比影响不显著，发酵条件优化后，金松酸最高产量可达0.22 g/L，比未优化前提高34.4％。
　　(4)脂肪酸的合成量是影响油脂产量的主要因素，乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸脱氢酶是决定脂肪酸合成的两个关键酶，乙酰辅酶A羧化酶将乙酰CoA羧化生成丙二酰单酰CoA，脂肪酸脱氢酶使微生物通过氧化去饱和途径生成不同种类的不饱和脂肪酸。实验结果表明，香榧内生真菌油脂的脂肪酸成分及所占质量百分比和香榧籽油高度相似，说明脂肪酸脱氢酶对两者的作用几乎相同，不是造成油脂产量差异的主要因素，因此，本研究对产油脂香榧内生真菌XF-38菌株的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)进行了活性测定及其羧基转移酶(CT)的克隆表达。实验测得香榧种仁细胞和XF-38菌株的ACC酶活有较大差异，分别为2259 U/L和1027 U/L;发现XF-38代谢产物4-苯甲酰基-2，2，6，6-四甲基哌啶对ACC酶活具抑制作用，当体系中浓度达到500 mg/L时，ACC基本失活。克隆XF-38菌株ACC的CT功能域基因，连接至表达载体PKC1139上，在Escherichia coli BL21(DE3)中成功表达，获得了CT活性域重组蛋白，发现4-苯甲酰基-2，2，6，6-四甲基哌啶可破环重组蛋白，进而影响ACC的脂肪酸合成作用，研究结果为今后通过消除抑制剂影响，提高功能性油脂产量提供实验室基础。

目录

声明

摘要

注释表

第一章 文献综述

1 概述

1．1 功能性油脂简介

1．2 香榧及香榧籽油营养功能成分

1．3 香榧资源开发局限性及解决方法

2 内生真菌发酵产油脂优点

2．1 产生和宿主相同或相似的功能性油脂产物

2．2 利用纤维素降低发酵成本

2．3 代谢产物特殊作用

3 内生真菌发酵产油脂国内外研究现状

3．1 脂肪酸合成机制研究

3．2 油脂产量影响因素研究

4 本研究的意义和主要研究内容

4．1 意义

4．2 主要研究内容

参考文献

第二章 产油脂香榧内生真菌的分离鉴定

1 引言

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果和分析

3．1 香榧内生真菌的分离

3．2 内生真菌产油脂性能测定

3．3 产油脂香榧内生真菌的鉴定

3．4 产油脂香榧内生真菌多样性分析

4 讨论

5 本章小结

参考文献

第三章 香榧内生真菌油脂的脂肪酸及不皂化物成分分析

1 引言

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果和分析

3．1 脂肪酸成分分析

3．2 不皂化物成分分析及比较

3．3 特殊功能性脂肪酸的分离

4 讨论

5 本章小结

参考文献

第四章 XF-38菌株发酵条件的优化

1 引言

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果和分析

3．1 XF-38菌株生长曲线的测定

3．2 XF-38株发酵条件优化

3．3 纤维素作碳源发酵XF-38试验

3．4 最优发酵条件下XF-38菌株的金松酸含量测定

4 讨论

5 本章小结

参考文献

第五章 产功能性油脂香榧内生真菌脂肪酸合成关键酶的克隆表达研究

1 引言

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果和分析

3．1 乙酰辅酶A羧化酶(ACC)活性

3．2 4-苯甲酰基-2，2，6，6-四甲基哌啶抑制ACC酶活测定

3．3 乙酰辅酶A羧化酶的CT功能域基因扩增

3．4 原核表达载体构建

3．5 目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

3．6 抑制剂对重组蛋白表达的影响

4 讨论

5 本章小结

参考文献

全文总结与展望

论文创新点

附录

致谢

攻读博士学位期间的相关研究论文