猪伪狂犬病毒变异毒株鉴别诊断PCR方法建立与基因缺失灭活疫苗免疫保护效力研究

摘要

猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的一种猪的急性传染病，临床上主要引起母猪的繁殖障碍、产死胎或木乃伊胎，仔猪出现神经症状，最后转归于死亡。近30年来我国广泛应用PRV基因缺失疫苗，使该病得到有效控制。但2011年底该病毒再次爆发流行，给我国的养猪业带来了空前巨大的损失。多个研究报告证明，该流行毒株毒力增强，抗原性发生明显变异。本研究通过对伪狂犬病的病原学与血清学检测，证明了该病在华东地区发生流行，成功建立了伪狂犬病毒经典毒株与变异毒株PCR鉴别诊断方法，并制备伪狂犬变异毒株基因缺失灭活疫苗，进行了免疫效果测定，为该病防控奠定了重要基础。本研究包括以下3个部分:
　　1.华东地区猪伪狂犬病流行病学调查与流行毒株分离鉴定
　　为了解猪伪狂犬病在华东地区发生与感染状况，本研究对2012-2015年江苏、山东、浙江和安徽四省进行了伪狂犬病血清学和病原学的流行病学调查与PRV流行毒株分离鉴定，结果为:(1)血清抗体:血清PRV gB抗体阳性率平均为92.3％(7119/7716); gE抗体阳性率从2012年的0％上升到2014年的34.9％，2015年降至31.6％，平均抗体阳性率达到30.7％(2189/7130)。在参与调查的4个省中浙江省阳性率最高，达到了42.1％，安徽最低，为24％。gE猪场阳性率2012-2015年分别为:0％、40.8％、55.0％、65.0％，平均阳性率为52.6％(162/308)，其中2014年4个省的猪场阳性率均为100％。(2)PRV PCR检测:2013-2015年PRV野毒感染率分别为14.1％、24.9％、28.9％，平均感染率为25.1％(121/481);猪场阳性率分别为:22.7％、36.5％、40.5％，平均猪场阳性率为37.3％。(3)病毒分离鉴定:从4份伪狂犬阳性病料中分离出4株病毒，经PCR鉴定均属于伪狂犬病毒流行毒株。以上数据表明伪狂犬病毒在华东地区广泛流行，为该病防控提供了理论依据。
　　2.鉴别伪狂犬经典毒株与变异毒株的PCR方法的建立
　　为了有效区分变异毒株和经典毒株，根据国内外伪狂犬病毒(PRV)变异毒株和经典毒株基因序列比对结果，针对UL44和UL36区域的基因序列设计了两对引物，建立两步法PCR。第一步PCR针对UL44区域，区分出经典毒株（疫苗株HB98除外）感染与变异毒株感染。第二步PCR针对UL36区域，区分出HB98与伪狂犬变异毒株。两步法PCR的敏感度分别达到2-20 TCID50和50TCID50病毒量。对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、日本脑炎病毒、脑心肌炎病毒和猪流行性腹泻病毒的核酸应用此方法进行扩增，结果均为阴性。该方法与猪伪狂犬病毒国家标准PCR检测方法的符合率达到91％，可用于该病实验室快速诊断。
　　3.猪伪狂犬病毒gE/gI缺失灭活疫苗制备与免疫保护效力试验
　　本研究通过对伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失毒株rZJ01△gE/gI进行灭活条件优化，采用3种不同佐剂制成灭活疫苗。小鼠免疫保护试验结果表明，甲醛灭活后辅以15A佐剂制成的疫苗（rZJ01/F/15A）免疫效果最好，一次免疫后3周即可产生较高水平PRV gB ELISA抗体，二次免疫后3周中和抗体效价达1∶158。猪体免疫保护试验结果表明，甲醛灭活辅以206佐剂制成的疫苗(rZJ01/F/206)免疫保护效果最好，一次免疫后3周即可产生较高水平的PRV gB ELISA抗体和中和抗体，二次免疫后2周gB抗体与中和抗体效价达1∶256。二次免疫后2周采用致死剂量的PRV ZJ01株攻击感染，非免疫攻毒组明显发病，而rZJ01/F/206组仅表现短时体温升高，肺脏、脑、肝脏组织中PRV载量最低，肉眼病变与组织学病变轻微，表明rZJ01/F/206可以有效保护PRV ZJ01强毒株攻击，可作为PRV的一种理想候选疫苗。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 病毒特性

1．1 感染宿主与致病性

1．2 病毒理化特性

1．4 病毒基因功能

1．5 病毒蛋白功能

1．6 病毒复制周期

2 流行病学调查

2．1 流行病学调查方法

2．2 流行病学调查结果

3 PCR检测方法

3．1 Taqman探针法

3．2 SYBR Green荧光定量法

3．3 普通PCR

3．4 多重PCR

4 疫苗研究进展

4．1 灭活疫苗

4．2 弱毒疫苗

4．3 DNA疫苗

参考文献

第二章 华东地区猪伪狂犬病流行病学调查与流行毒株分离鉴定

1 材料与方法

1．1 病料及处理

1．2 试剂、仪器、试验动物

1．3 细胞、病毒、血清

1．4 引物与PCR反应条件

1．5 病毒DNA的提取

1．6 病毒分离

1．7 病毒半数细胞感染量的测定

1．8 病毒半数致死量测定

1．9 伪狂犬病毒ELISA抗体检测

2 结果

2．1 血清抗体检测结果

2．2 PRV PCR检测结果

2．3 病毒分离与鉴定

3 讨论

参考文献

第三章 鉴别伪狂犬经典毒株与变异毒株的PCR方法的建立

1 材料和方法

1．1 主要试剂和材料

1．2 病毒和病料

1．3 引物设计与合成

1．4 病毒DNA提取

1．5 病毒RNA提取与反转录

1．6 两步法PCR

1．7 特异性试验

1．8 敏感性试验

1．9 常规PRV gE PCR检测方法

1．10 国家标准PRV gE PCR检测方法

2 结果

2．1 PCR扩增结果

2．2 特异性试验

2．3 敏感性试验

2．4 重复性试验

2．5 临床样品检测结果

3 讨论

参考文献

第四章 猪伪狂犬病毒gE／gI缺失灭活疫苗制备与免疫保护效力试验

1 材料和方法

1．1 细胞、病毒与实验动物

1．2 实验试剂、仪器

1．3 最适灭活剂与灭活条件的选择

1．4 攻毒剂量的确定

1．5 小鼠的免疫保护试验

1．6 猪体免疫保护试验

2 结果

2．1 最适灭活剂与灭活条件的选择

2．2 小鼠攻毒剂量确定

2．3 小鼠免疫保护试验

2．4 猪体免疫保护试验

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢