热应激影响大鼠黄体功能性退化的作用机制研究

摘要

热应激影响雌性动物的许多生殖功能，如卵泡发育、卵母细胞成熟和早期胚胎发育。目前，研究表明热应激通过干扰动物的生殖内分泌等发挥作用。同时，热休克反应依赖于细胞信号途径的调控。因此，本论文以假孕大鼠为研究对象，建立热应激模型。应用ELISA、Western blot和IHC等方法，研究孕酮合成及分解代谢相关蛋白及相关信号通路元件的表达模式，以揭示热应激影响卵巢黄体退化的作用机制，为研究热应激影响雌性动物繁殖性能提供理论依据。主要内容如下:
　　1热应激对大鼠黄体孕酮合成及分解代谢相关蛋白表达的影响
　　为探讨热应激对黄体孕酮合成及分解代谢通路相关蛋白表达的影响，本研究采用PMSG/hCG(D0)联合处理70只(28日龄)大鼠诱导假孕，然后随机分为非热应激(NHS)和热应激(HS)两组。每天在相同时间，将HS组置于40℃热应激2h。每天测定大鼠的饮水量、采食量及热应激前后的直肠温度。假孕第3天，热应激结束后2h，采集两组大鼠的血清和卵巢组织(n=5)。假孕第7天，热应激结束后2h，处死或PGF分别处理0h、1h、2h、8h或24 h后处死，然后收集血清和卵巢组织(n=5)。应用ELISA检测血清孕酮浓度、Western blot和IHC检测孕酮合成及分解代谢通路相关蛋白的表达。ELISA结果表明，热应激对黄体形成过程中孕酮浓度无显著影响。Western blot结果表明热应激对黄体形成过程中StAR、P450scc和3βHSD表达无显著影响，但PKA磷酸化底物在第3天表达高于第7天(P＜0.05)。PGF降低了两组大鼠血清孕酮浓度，且热应激抑制了PGF诱导的孕酮浓度下降(P＜0.05);PGF或热应激单一处理均对PKA磷酸化底物、StAR、P450scc、3βHSD及NR4A1-F表达无显著影响，但均诱导NR4A1-S表达上调(P＜0.05)，且热应激降低PGF诱导的NR4A1-S表达(P＜0.05);IHC结果表明，PKA磷酸化底物主要在黄体细胞的细胞核中表达，而StAR、P450scc、3βHSD和NR4A1-F均在黄体细胞的细胞质表达。上述结果提示，热应激降低假孕大鼠PGF诱导的黄体退化过程中NR4A1-S的表达，NR4A1-S可能参与调控黄体退化过程中孕酮的分解代谢。
　　2热应激对大鼠黄体退化中ERK1/2磷酸化及HSP70与ATF3表达的影响
　　为研究热应激对PGF诱导的黄体退化过程中HSP70及MAPK/ATF3和PKB信号通路元件表达的影响，以假孕大鼠为试验对象，构建热应激模型（同试验1）。假孕第7天，热应激结束2h后，大鼠以PGF分别处理0h、1h、2h、8h或24 h后处死，收集卵巢组织。应用Western blot和IHC检测HSP70及MAPK/ATF3和PKB信号通路元件蛋白的表达。Western blot结果表明:与NHS组相比，热应激没有改变HSP70和p-ERK-1/2的基础水平，但热应激促进PGF诱导的HSP70和p-ERK-1/2水平的上升(P＜0.05);热应激促进p-p38 MAPK基础水平的上调(P＜0.05);在PGF处理2h后，ATF3的表达量显著上升，且热应激抑制PGF诱导的ATF3表达(P＜0.05)。对于PKB通路，在PGF处理8h和24 h后，p-Akt(Thr308/Ser473)的表达量显著降低(P＜0.05)，但热应激对其没有显著影响。这些结果提示，在PGF诱导的假孕大鼠黄体退化过程中，热应激促进HSP70和p-ERK-1/2表达，抑制ATF3的表达，这可能有助于减少PGF诱导孕酮的下降，维持黄体功能。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词(Abbreviation)

第一章 黄体的研究进展

1 黄体形成与发育的过程

2 黄体的组成与分类

3 黄体的主要功能

3．1 胆固醇的生成

3．2 胆固醇的转运

3．3 孕酮的生物合成及分解代谢

4 PGF2α溶解黄体的作用机制

4．1 血流和血管的变化

4．2 PGF2α抑制孕酮合成

参考文献

第二章 热应激与热休克蛋白70

1 热应激的概念及机理

2 HSP70及生物学功能

2．1 HSP70的分类

2．2 HSP70的分子结构

2．3 HSP70的表达调控

2．4 HSP70的生物学功能

3 HSP70相关细胞信号通路研究进展

3．1 MAPK／ATF3通路

3．2 PI3K／Akt通路

3．3 HSP70与MAPK和Akt通路的关系

4 本研究的目的与意义

参考文献

第三章 热应激对大鼠黄体孕酮合成及分解代谢相关蛋白表达的影响

1．1 材料

1．2 方法

1．3 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 热应激对假孕大鼠饮水量和采食量的影响

2．2 热应激对假孕大鼠直肠温度的影响

2．3 热应激对假孕大鼠体重和卵巢重的影响

2．4 热应激对假孕大鼠黄体形成过程中孕酮及其合成相关蛋白表达的影响

2．5 热应激对假孕大鼠黄体退化过程中孕酮浓度及其合成和分解代谢途径相关蛋白表达的影响

2．6 假孕大鼠孕酮合成及分解代谢途径相关蛋白免疫组织化学定位

3 讨论

3．1 热应激对假孕大鼠黄体形成过程中孕酮及其合成及分解代谢通路的影响

3．2 热应激对假孕大鼠黄体退化过程中孕酮及其合成及分解代谢通路的影响

参考文献

第四章 热应激对大鼠黄体退化中ERK磷酸化及HSP70与ATF3表达的影响

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 热应激对假孕大鼠黄体退化过程中HSP70表达的影响

2．2 热应激对假孕大鼠黄体退化过程中ERK-1／2和p38 MAPK的磷酸化水平的影响

2．3 热应激对假孕大鼠黄体退化过程中ATF3表达的影响

2．4 热应激对假孕大鼠黄体退化过程中Akt(Thr308／Ser473)磷酸化水平的影响

3 讨论

3．1 热应激对假孕大鼠黄体退化过程中HSP70表达的影响

3．2 热应激对假孕大鼠黄体退化过程中MAPKs／ATF3通路的影响

3．3 热应激对假孕大鼠黄体退化过程中PKB通路元件表达的影响

参考文献

全文结论

创新点

附录

攻读硕士期间发表的论文

致谢