神经介素U及其受体在猪体内的分布和对猪免疫调节作用的研究

摘要

神经介素U(neuromedin U，NMU)是上世纪80年代从猪脊髓分离的一种神经肽，通过其2个受体（NMUR1和NMUR2）发挥生理功能。NMU及其受体广泛分布于中枢神经系统和外周组织器官，并参与多种生理功能的调节，包括刺激平滑肌收缩、调节摄食和能量平衡、影响胃肠功能、血压和血流、激素分泌、疼痛感知、骨骼重建和应激等。目前，有资料表明NMU对机体免疫也有一定的影响，但研究对象主要为人和鼠，且资料有限，关于猪NMU及其受体的基因克隆、分布定位及其免疫功能的研究，鲜有报道。因此，本试验以小梅山猪为研究对象，采用基因克隆、荧光定量PCR、免疫组织/细胞化学、放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法，探索了NMU及其受体在猪体内的分布定位以及在体内外对猪炎性细胞因子分泌的影响，以期为NMU调控猪的免疫功能提供形态学和生理学资料。 一、NMU及其受体基因克隆 本试验采用基因克隆技术，从小梅山猪睾丸中克隆了猪NMU、NMUR1和NMUR2基因的编码区序列(coding sequence，CDs)片段，并对其基因序列及推导出的其氨基酸序列进行了生物信息学分析，结果如下: 1.克隆获得的猪NMU、NMUR1和NMUR2基因片段，大小分别为522bp、1662bp和1233bp，分别编码174、554和411个氨基酸。现已将猪NMU、NMUR1和NMUR2基因序列提交至GenBank数据库(登录号分别为KJ622334.1、KJ622336.1和KJ622335.1)。 2.猪NMU、NMUR1和NMUR2基因序列分析发现，其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列高度保守，特别是猪NMU、NMUR1和NMUR2CDs序列在不同物种间高度同源。猪NMU、NMUR1和NMUR2分别定位于猪的8号、15号和16号染色体。猪NMUR1和NMUR2结构与G蛋白偶联受体家族相似，具有典型的7次跨膜结构。猪NMUR1和NMUR2氨基酸序列上有3种磷酸化位点。 二、NMU及其受体在猪体内的表达 本试验采用荧光定量PCR探索了NMU及其受体在猪体内的表达，结果如下: NMU mRNA在中枢和外周表达广泛，NMU mRNA最高表达在垂体和子宫;在十二指肠、空肠、回肠、结肠、软腭扁桃体、肝、脊髓和骨髓呈高水平表达。 NMUR1mRNA主要表达在外周组织器官，最高表达在输精管;在十二指肠、空肠、输卵管、胃、脂肪、胰、食管、肾、睾丸、胸腺、小脑呈高水平表达。 NMUR2mRNA主要表达在中枢器官，最高表达在输精管、大脑皮质;在延髓、下丘脑、睾丸、输卵管、中脑、胰、脊髓、垂体呈高水平表达。 三、NMU和NMUR1在猪体内的分布定位 本试验采用免疫组织化学技术，对NMU和NMUR1免疫阳性细胞在小梅山猪体内的分布定位进行了研究。结果如下: 1.NMU和NMUR1免疫阳性神经元主要分布于下丘脑室旁核（PVN）和脊髓背角。腺垂体细胞呈现较强的NMU和NMUR1免疫阳性。 2.NMU和NMUR1免疫阳性细胞广泛分布在呼吸器官（气管和肺）、消化器官（胃、十二指肠、肝和胰）、泌尿生殖器官（肾、睾丸、输尿管、卵巢和子宫）、淋巴器官（胸腺、空肠淋巴结、脾和软腭扁桃体）等。 四、神经介素U在体外对猪脾淋巴细胞和肺泡巨噬细胞免疫功能的影响 本试验采用免疫细胞化学技术，检测了NMU和NMUR1在猪脾淋巴细胞和肺泡巨噬细胞中的分布;研究了NMU与PHA/LPS共同或单独刺激脾淋巴细胞对其体外增殖的影响;同时研究了不同浓度NMU刺激肺巨噬细胞、对其吞噬作用和炎性细胞因子分泌的影响。结果如下: 1.免疫组化结果显示，NMU和NMUR1分别在脾淋巴细胞和肺泡巨噬细胞都有分布。 2.不同浓度的NMU均能刺激猪脾淋巴细胞增殖，且具有剂量依赖关系。单独的PHA/LPS能够显著促进猪脾淋巴细胞增殖(P＜0.05)。NMU对于PHA/LPS刺激猪脾淋巴细胞增殖具有协同作用，各剂量的NMU+PHA组和NMU+LPS组能够促进猪脾淋巴细胞增殖，而且其作用显著高于单独的NMU组或PHA组/LPS组(P＜0.05)。 3.NMU在体外能促进猪肺泡巨噬细胞吞噬中性红。 4.NMU能够对猪肺泡巨噬细胞炎性细胞因子的分泌产生影响，且与孵育时间和剂量相关。不同浓度NMU在体外能促进肺泡巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-γ和TNF-α;低浓度NMU在体外促进巨噬细胞分泌IL-5、IL-13、IL-4和IL10;高浓度NMU抑制巨噬细胞分泌IL-5、IL-13、IL-4和IL-10。 5.NMU能够对脾淋巴细胞炎性细胞因子的分泌产生影响，且与孵育时间和剂量相关。不同浓度NMU在体外都能促进脾淋巴细胞分泌IL-1β、IL-5、IL-6、IL-8、TNF-α和IL-4;各剂量NMU下调脾淋巴细胞IFN-γ的分泌;低浓度NMU抑制脾淋巴细胞分泌IL-10，高浓度NMU促进脾淋巴细胞分泌IL-10。低浓度组上调脾淋巴细胞IL-13的分泌，高浓度(1000nM)NMU下调脾淋巴细胞IL-13的分泌。 五、侧脑室注射神经介素U对猪血清细胞因子水平的影响 为了研究中枢给予NMU对猪血清中炎性细胞因子表达水平是否有影响，本试验采用侧脑室注射方法，利用ELISA和RIA技术，研究了猪侧脑室分别注射不同浓度的NMU对血清中促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α）和抑炎细胞因子(IL-10)分泌量的影响，结果如下: 1.侧脑室注射NMU能够促进猪促炎细胞因子的分泌。高、中剂量NMU均能上调猪IL-1β、IL-6、IL-8和TN1F-α的分泌，但低剂量NMU只能上调猪IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。在高、中剂量组，注射后较短时间内IL-1β和IL-8即可达到分泌峰值，IL-6在70～90min内达到分泌的峰值;高、中剂量组注射NMU分别在20min和50min TNF-α分泌量达到第一个峰值，在注射后90min和100min分别达到第二个峰值;低剂量组IL-1β、IL-6和TNF-α分泌量一直维持较高水平，而IL-8基本与对照组相似。 2.侧脑室注射NMU对猪血清抑炎细胞因子的影响:高、中剂量组可以促进IL-10的分泌，并在注射后50和40min分别达到第一个波峰，在100和90min分别达到第二个波峰。低剂量组不能显著诱导IL-10的分泌。 综上所述，本研究克隆了猪NMU及其受体（NMUR1和NMUR2）基因的CDs片段，并对NMU、NMUR1和NMUR2核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行了序列比对和分析。NMU及其受体广泛分布于猪中枢和外周器官。NMU和NMUR1同样分布于体外培养的猪肺泡巨噬细胞和脾淋巴细胞，NMU对猪肺泡巨噬细胞和脾淋巴细胞免疫功能具有调节作用。侧脑室注射NMU能对猪血清中炎性细胞因子分泌产生影响。这些研究结果对于了解NMU作为一种免疫调节因子、参与猪体免疫调节作用具有重要意义，为NMU参与调控猪的免疫功能提供了形态学和生理学资料。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩写词表

引言

第一章NMU及其受体结构和生理功能

1 NMU的发现和结构

2 NMU的结构与活性关系

3 NMU的分布定位

3．1 NMU在中枢神经系统的分布定位

3．2 NMU在外周组织器官的分布定位

4 NMU受体

4．1 NMU受体的发现

4．2 NMUR1和NM-UR2的结构特征

4．3 NMUR1和NMUR2的表达分布

5 NMU对细胞信号通路的影响

6 NMU的生理作用

6．1平滑肌收缩

6．2血压和区域血流量

6．3 NMU对下丘脑-垂体-肾上腺轴和应激反应的调节

6．4 NMU对摄食和能量平衡的调节作用

6．5 NMU对胃酸分泌和胃排空的影响

6．6 NMU对离子运输的影响

6．7癌症

6．8 NMU对感知疼痛反应的影响

6．9 NMU对免疫调节作用

7小结

第二章神经介素U及其受体基因克隆

1材料和方法

1．1 试验动物

1．2试验试剂

1．3主要仪器设备

1．4试验方法

2结果

2．1 NMU、NMUR1和NMUR2基因CDs序列片段的克隆

2．2 NMU测序结果及分析

2．3 NMUR1测序结果及分析

2．4 NMUR2测序结果及分析

2．5 NMUR1和NMUR2氨基酸序列比对结果

3 讨论

3．1猪NNU、NMUR1和NMUR2基因CDs序列片段的克隆

3．2猪NMU序列分析

3．3 NMUR1和NMUR2序列分析

4小结

参考文献

第三章神经介素U及其受体在猪体内的表达

1材料和方法

1．1试验动物

1．2试验试剂

1．3主要仪器设备

1．4试验方法

2结果

2．1 NMU mRNA在猪体内的表达

2．2 NMUR1 mRNA在猪体内的表达

2．3 NMUR2 mRNA在猪体内的表达

3讨论

3．1 NMU mRNA在猪体内的表达

3．2 NMUR1 mRNA在猪体内的表达

3．2 NMUR2 mRNA在猪体内的表达

4 小结

参考文献

第四章NMU和NMUR1在猪体内的分布定位

1．1 试验动物

1．2试剂与仪器

1．3试验方法

2 结果

2．1 猪NMU的分布定位

2．2猪NMUR1的分布定位

3 讨论

4 小结

参考文献

第五章NMU在体外对猪脾淋巴细胞和肺泡巨噬细胞免疫功能的影响

1．1 试验动物

1．2试验试剂

1．3主要仪器设备

1．4试验方法

1．5统计分析

2 结果

2．2NMU对脾淋巴细胞体外增殖的影响

2．3 NMU对肺泡巨噬细胞吞噬作用的影响

2．4NMU对肺巨噬细胞分泌促炎细胞因子IL-1β、IL-5、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ的影响

2．5 NMU对肺泡巨噬细胞分泌抑炎细胞因子IL-4、IL10和IL-13的影响

2．6 NMU对脾淋巴细胞促炎细胞因子IL-1β、IL-5、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ的影响

2．7 NMU对脾淋巴细胞分泌抑炎细胞因子IL-4、IL10和IL-13的影响

3讨论

4小结

参考文献

第六章侧脑室注射NMU对猪血清中细胞因子的影响

1．1试验动物

1．2试验试剂

1．3主要仪器设备

1．4试验方法

1．5统计分析

2结果

2．1侧脑室注射NMU7对血清中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平的影响

2．2侧脑室注射NMU对血清中抑炎细胞因子IL-10水平的影响

3 讨论

3．1 侧脑室注射NMU对血清细胞因子水平的影响

4 小结

参考文献

全文结论

论文创新点

附录

博士期间发表的论文

致谢