神经肽S及其受体在猪体内的分布和对猪免疫调节功能影响的研究

摘要

神经肽S(Neuropeptide S，NPS)是2002年由SatoS等人运用反向药理学方法鉴别出的一种由20个氨基酸组成的神经肽。由于其N-端氨基酸残基在所有已测定物种中均为丝氨酸(serine，S)，故Reinscheid RK等人将其命名为Neuropeptide S。NPS通过其受体(NPS receptor，NPSR)发挥生理作用。NPS及其受体构成了一种新的神经肽系统( NPS/NPSR)，广泛分布于中枢神经系统和外周组织器官。NPS/NPSR系统参与调节多种重要的生理功能，包括觉醒、焦虑、应激、摄食、镇痛和学习记忆等。目前，有资料表明NPS对机体免疫也有一定的影响，但研究对象主要为人和鼠，且资料有限，关于猪NPS和NPSR基因及其免疫功能的研究，尚未见报道。因此，本试验以小梅山猪为研究对象，采用基因克隆、半定量RT-PCR、免疫组织化学(IHC)、放射免疫测定（RIA）和酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法，探讨了NPS及其受体在猪体内的分布定位和对猪免疫功能的影响，以期为NPS/NPSR系统调控猪的免疫功能提供形态学和生理学资料．结果如下：
　　 一神经肽S及其受体基因克隆及组织表达
　　 本试验采用同源克隆技术，首次从小梅山猪脑干组织中克隆了猪NPS及其受体(NPSR)基因的编码区序列(coding sequence，CDs)片段，对猪NPS和NPSR核苷酸序列及推导出其编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析，包括序列比对、同源分析、染色体定位、系统进化分析、结构预测、受体的跨膜特征预测和磷酸化位点预测，并运用半定量RT-PCR方法探讨了NPS及其受体在猪体内的表达分布．结果如下：
　　 1克隆得到猪NPS和NPSR基因片段，长度分别为183bp和443bp，分别编码59个和147个氨基酸。已将猪NPS和NPSR基因序列提交至GenBank数据库（基因登录号分别为FJ024707和FJ444795）．
　　 2对猪NPS和NPSR基因序列进行分析，发现其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列具有高保守性，尤其是与不同物种的NPS编码区序列间高度同源，其中猪NPS CDs核苷酸序列与人、兔、牛和大鼠序列的同源性分别为90.0％，98.3%，88.3%和86.7%。猪NPS在物种的进化中高度保守，与兔的亲缘关系最近．猪NPS N-端的7个氨基酸序列与已知其他所有物种完全保守。预测NPS和NPSR分别定位于猪的4号和18号染色体(4q/18q)，不同于在人类染色体上的定位(10q25/7p14-15)。猪NPSR的结构与G蛋白偶联受体家族相似，具有典型的跨膜结构。预测NPS氨基酸序列上有2种蛋白激酶磷酸化位点，NPSR氨基酸序列上有6种蛋白激酶磷酸化位点。
　　 3 NPS和NPSR mRNA在猪的中枢神经系统和外周组织器官广泛表达。NPSmRNA以脑干（延髓和脑桥）、垂体、脾和肺中的表达水平最高；在卵巢、大脑皮质、腮腺、乳腺、中脑、甲状腺、腭帆扁桃体、睾丸、横结肠、小脑、胰、嗅球、十二指肠、海马、气管、心、食管、空肠淋巴结、附睾、空肠、胸腺、胃、盲肠、下丘脑、肾上腺和回肠中呈中等水平的表达；在肾中表达水平最低。NPSRmRNA在垂体、脾和腮腺中表达水平较高；在甲状腺、睾丸、气管、海马、肺、食管、十二指肠、胸腺、心、肾、横结肠、空肠淋巴结、回肠、乳腺、大脑皮质、嗅球、小脑、延髓和卵巢表达水平中等；在中脑、胃、胰、附睾和肾上腺也有少量表达；但在下丘脑、脑桥、空肠，盲肠和腭帆扁桃体中未检测到NPSR mRNA的表达。总的来说，NPS mRNA表达水平较高的组织主要位于中枢神经系统，而NPSR mRNA表达水平较高的组织主要位于外周组织器官。
　　 二神经肽 S在猪体内的分布定位
　　 本试验采用免疫组织化学方法，对NPS免疫阳性细胞及其纤维在小梅山猪体内的分布定位进行了研究。结果如下：
　　 1NPS免疫阳性神经元在猪的中枢神经系统有着广泛的分布。胞体大小不一，形态多样，呈卵圆形、纺锤形和多极形等。主要分布于三叉神经感觉主核(Pr5)、蓝斑(LC)、禊束核(CUR)前部、极后区(AP)、丘脑腹内侧核(MV)、枕核( PUL)、下丘脑室旁核（PVN）和下丘脑后区(HPA)；垂体、小脑颗粒细胞层(GRL)和嗅球室管膜下层(SEL)中也有少量分布。在端脑、间脑、脑桥、小脑和嗅球中有形态不一、数量不等的NPS免疫阳性神经纤维的广泛投射。以下丘脑中NPS免疫阳性神经纤维的分布最为广泛和密集。
　　 2NPS免疫阳性细胞在猪的外周组织器官广泛分布，包括呼吸器官（气管和肺）、消化器官（食管、胃和肠）、内分泌器官（甲状腺，肾上腺和腺垂体）、泌尿生殖器官（肾、睾丸和卵巢）、淋巴器官及组织（空肠淋巴结、脾和弥散淋巴组织）、肌肉（胸肌和多种器官的平滑肌）和乳腺等．
　　 3 NPS的分布在种属间既存在保守性，也存在种间差异．
　　 三神经肽S在体外对猪脾淋巴细胞和肺泡巨噬细胞免疫功能的影响
　　 本试验采用RT-PCR方法检测了NPS及其受体mRNA在猪脾淋巴细胞(SPLs)和肺泡巨噬细胞(PAMs)中的表达，并用免疫细胞化学法检测了NPS在这两种免疫细胞中的分布；研究了各剂量NPS(0.01，0.1、1、10、100和1000nM)单独或与PHA/LPS共同刺激SPLs，对其体外增殖的影响；进一步研究了上述各剂量NPS刺激PAMs，对其吞噬作用和促炎/抑炎细胞因子分泌的影响。
　　 结果如下：
　　 1NPS及其受体mRNA在猪SPLs和PAMs中均有表达，且免疫组化结果显示NPS分布于SPLs和PAMs的胞膜和胞浆。
　　 2 NPS(0.01—100nM)可促进SPLs的体外增殖，且当NPS浓度为InM时，增殖水平达到峰值，而与PHA或LPS协同作用时，较低浓度的NPS（0.01一1 nM）即可达到相同的效果。
　　 3NPS(0.01-1000nM)可以剂量依赖方式促进PAMs吞噬荧光标记的大肠杆菌，1-10nMNPS能够诱导PAMs的吞噬作用达到峰值。
　　 4NPS能够对PAMs细胞因子的分泌产生影响，且与孵育时间、剂量和是否有LPS的协同相关。在有LPS存在时，NPS(0.01～100nM)可促进PAMs促炎细胞因子（IL-lB、IL-6和TNF-a）的分泌；单独NPS（0.01—1000nM）能够对抑炎细胞因子（IL-4和IL-1O）的分泌产生影响，表现为低剂量NPS(0.0l-0.1nM)抑制IL-4的分泌，高剂量NPS（1-1000nM）反而起促进作用，但对IL-IO的作用则相反；在有LPS存在时，一定剂量NPS也可促进PAMs分泌IL-4(10-1000nMNPS)和IL-10（1nM NPS）．在有LPS存在时，NPS可在一定孵育时间内（4-12h）促进促炎细胞因子的分泌，且NPS还有协同LPS促进IL-1B（孵育4h），IL-6（孵育8-12h）和TNF-a(孵育4一12h)分泌的作用；在一定孵育时间内，NPS可促进IL-4(4 h)和IL-1O(2h和8h)的分泌，NPS能协同LPS促进(4 h)或抑制（8-12h）IL-4的分泌。
　　 四侧脑室注射神经肽S对猪血清及免疫器官中细胞因子水平的影响
　　 为了探讨中枢NPS对猪血清及免疫器官中促炎和抑炎细胞因子水平是否有影响，本试验结合侧脑室注射方法，采用放射免疫测定（RIA）、酶联免疫吸附测定(ELISA)和半定量RT-PCR方法，研究了猪侧脑室分别注射高剂量(30nmol)和低剂量（10nmol）的NPS后，对血清促炎细胞因子(IL-1B、IL-6和TNF-a)和抑炎细胞因子（IL-4和IL-10）含量的影响，以及免疫器官（胸腺，脾、空肠淋巴结和腭帆扁桃体）中上述细胞因子mRNA和蛋白水平的影响。结果如下：
　　 1侧脑室注射NPS对猪血清促炎细胞因子的影响：高、低剂量NPS均能上调猪血清IL-6和TNF-a含量，高剂量NPS亦可上调血清IL-1B含量．在注射后较短时间（10-70min）内即可达到分泌峰值，高水平的促炎细胞因子能持续20-110 min，IL-1B和TNF-a在2h内可恢复至对照组水平，但IL-6在注射后2h仍保持在较高水平。NPS对血清促炎细胞因子的促进作用的特点（起效时间、维持时间、达峰时间及峰值）与NPS的剂量相关，可能还与血清细胞因子自身的分泌特点有关。
　　 2侧脑室注射NPS对猪血清抑炎细胞因子的影响：对猪血清IL-4和IL-10的影响与上述对促炎细胞因子的影响不同，表现为低剂量NPS能够下调血清IL-4含量，而高剂量NPS能够上调血清IL-4含量，但对血清IL-10的影响则相反，这与NPS在体外对PAMs分泌抑炎细胞因子的影响相似。IL-4和IL-10在2h内可恢复至对照组水平。NPS对血清抑炎细胞因子的促进作用的特点也与NPS的剂量相关，可能还与血清细胞因子自身的分泌特点有关。
　　 3侧脑室注射NPS对猪免疫器官中促炎细胞因子的影响：高剂量NPS能上调腭帆扁桃体和脾中IL-1B和IL-6含量，但下调空肠淋巴结TNF-a含量；低剂量NPS能上调腭帆扁桃体中IL-1β、IL-6和TNF-a含量，及脾中IL-1β和IL-6含量，但下调胸腺和空肠淋巴结Ⅱ-β和IL-6含量。除低剂量NPS仅对腭帆扁桃体中TNF-a蛋白水平有上调作用外，NPS对免疫器官各促炎细胞因子mRNA水平的影响，与对蛋白水平影响趋势基本一致。
　　 4侧脑室注射NPS对猪免疫器官中抑炎细胞因子的影响：高剂量NPS能上调胸腺、脾中IL-4和腭帆扁桃体、胸腺中的IL-10含量，下调腭帆扁桃体中IL-4和脾中IL-10含量；低剂量NPS能上调胸腺IL-4含量，下调空肠淋巴结的IL-4含量。除高、低剂量NPS仅对空肠淋巴结中IL-10mRNA水平有下调作用，及高剂量NPS仅对腭帆扁桃体IL-10mRNA水平有上调作用外，NPS对免疫器官中各抑炎细胞因子在mRNA水平的影响，与对蛋白水平影响趋势基本一致．
　　 五静脉注射神经肽S对猪血清及免疫器官中细胞因子水平的影响
　　 为了探讨外周NPS对猪血清及免疫器官中促炎和抑炎细胞因子水平是否也有影响，本试验采用放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和半定量RT-PCR方法，研究了猪静脉分别注射高剂量（6ug/kg体重）和低剂量(3μg/kg体重)的NPS后，对血清促炎细胞因子（IL-Iβ、IL-6和TNF-a）和抑炎细胞因子（IL-4和IL-10）含量的影响，以及免疫器官（胸腺、脾、空肠淋巴结和腭帆扁桃体）中上述细胞因子mRNA和蛋白水平的影响．结果如下：
　　 1静脉注射NPS对猪血清细胞因子的影响：高、低剂量NPS均能上调血清促炎细胞因子（IL-1β和IL-6）和抑炎细胞因子（IL-4和IL-10）的含量，高剂量NPS亦可上调血清TNF-a的含量，在注射后30-80min即可达到分泌峰值，高水平的促炎和抑炎细胞因子同样能持续20一110min，并在2h内可恢复至对照组水平。与脑室注射NPS相似，血清细胞因子的起效时间、维持时间、峰值时间和水平等与NPS的剂量以及细胞因子各自的分泌特点有关．
　　 2静脉注射NPS对猪免疫器官中促炎细胞因子的影响：各促炎细胞因子mRNA和蛋白水平的变化趋势基本一致。高剂量NPS除了对空肠淋巴结中IL-1β，脾和胸腺（仅mRNA水平）中IL-6含量有下调作用，及对空肠淋巴结中TNF-a无影响外，对其他免疫器官的促炎细胞因子均有上调作用；低剂量NPS能上调腭帆扁桃体、脾中IL-1β和空肠淋巴结中IL-6含量，能下调胸腺中IL-1β、IL-6和空肠淋巴结中IL-1β含量，仅在蛋白水平下调腭帆扁桃体中IL-6、TNF-a和脾中TNF-a含量。
　　 3静脉注射NPS对免疫器官中抑炎细胞因子的影响：各抑炎细胞因子mRNA和蛋白水平的变化趋不完全一致。高剂量NPS能上调胸腺和脾（仅在蛋白水平）中IL-4含量，下调腭帆扁桃体、空肠淋巴结（仅在mRNA水平）中IL-4，空肠淋巴结中IL-10含量；低剂量NPS能上调空肠淋巴结中IL-4和胸腺中IL-10含量，在mRNA水平下调腭帆扁桃体中IL-4、IL-10和脾中IL-10的含量。
　　 综上所述，本研究首次克隆了猪NPS及其受体(NPSR)基因的CDs片段，经生物信息学分析，发现其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列具有高保守性；研究了NPS及其受体在猪淋巴器官、其他免疫相关组织以及免疫细胞(SPLs和PAMs)的分布，为NPS参与猪免疫功能的调控提供了形态学依据．体外试验表明，NPS对SPLs的体外增殖和PAMs的吞噬作用及细胞因子分泌等免疫功能有一定影响；体内试验表明，中枢和外周NPS均能对猪血清和免疫器官中细胞因子产生影响．这对进一步了解NPS作为一种免疫调节因子，参与猪的细胞和体液免疫，及NPS在免疫调节中的作用具有重要意义，本研究从mRNA水平到蛋白水平，从形态、分布到功能，从体外研究到体内研究，为NPS参与调控猪的免疫功能提供了形态学和生理学的第一手资料．