抑制p38MAPK信号通路对热处理奶牛乳腺上皮细胞蛋白差异表达的影响

摘要

p38MAPK信号通路能调控动物应激应答反应，对动物应激保护有重要作用，有关p38MAPK信号通路对动物应激保护作用已有相关研究，但p38MAPK信号通路对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞保护作用的机制尚不清楚。本试验通过p38MAPK特异性抑制剂作用于热处理后体外培养的奶牛乳腺上皮细胞进行研究，测定其对乳腺细胞活力、凋亡、蛋白表达方面的影响，从细胞水平探讨抑制p38MAPK信号通路对热应激下奶牛乳腺上皮细胞的影响。本试验分为两个部分: 1、p38MAPK抑制剂对热处理下奶牛乳腺上皮细胞活力、凋亡及细胞抗氧化指标的影响 37℃组（正常处理组）在37℃培养箱孵育6.5h，41℃组（热处理组）用含不同浓度（0、1、5、10、20、40μmol/L）的SB203580DMEM培养基处理细胞30min后，在41℃培养箱孵育30min，最后在37℃培养箱恢复6h。采用MTT法测定热处理对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞活力的影响，通过AnnexinⅤ-FITC双染法、利用流式细胞仪测定细胞的凋亡率。采用SOD、GSH-px、MDA试剂盒，测定细胞中SOD活性、GSH-px含量、MDA含量。结果表明，正常处理组的细胞活力明显高于热处理组（P＜0.05）;当添加不同浓度特异性SB203580抑制剂后，在41℃组中，添加5、10μmol/L的抑制剂（SB2组、SB3组），细胞的活力有上升趋势; 正常处理组中细胞凋亡率极显著低于热处理组(P＜0.01)，41℃的热处理能够引起的细胞显著凋亡;当添加不同浓度p38MAPK特异性抑制剂SB203580后，热处理组中，5μmol/L组、10μmol/L组的细胞凋亡率与0μmol/L组相比显著降低（P＜0.05），热处理组10μmol/L组的细胞凋亡率较各组低。 热处理组SOD、GSH-px活力明显低于正常处理组(P＜0.01)，当添加10μmol/LSB203580后，SOD、GSH-px活力极显著高于0μmol/L热处理组（P＜0.01）。热处理后，细胞内MDA含量显著高于正常组（P＜0.05），添加1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L SB203580显著降低细胞内MDA含量(P＜0.05)，热处理组中添加10μmol/L SB203580组细胞内MDA含量最低。 综合对细胞活力和细胞凋亡两个方面的检测发现，在蛋白差异表达试验中采用添加10μmol/L浓度梯度的p38MAPK特异性抑制剂SB203580进行。热处理使细胞受到氧化应激，抑制p38MAPK可以缓解细胞氧化应激损伤。 2、激活和抑制p38MAPK条件下乳腺上皮细胞差异蛋白质的筛选 从蛋白的水平来筛选激活和抑制前后的差异蛋白质。在本试验中，分别将乳腺上皮细胞进行3组处理:对照组（Control），不作任何处理的细胞中加入基础培养基继续常规培养;热处理组用含浓度0μmol/L(HS组)、10μmol/L(SB组)浓度的SB203580DMEM完全培养基处理细胞30min后，41℃热处理细胞0.5h，37℃恢复6h，运用相对和绝对定量技术和液相色谱法识别不同的调节蛋白。将样品中鉴定到的蛋白和COG、GO、KEGG数据库进行比对，表明蛋白主要富集在general function prediction only、posttranslational modification,protein turnover,chaperopnes和translation,ribosomal structure and biogenesis三种条目。将HS组与不作处理组相比较获得逆转差异表达的蛋白，将SB组与HS组进行比较获得相应的逆转差异蛋白。共筛选出34个逆转显著差异表达的蛋白，其中与空白组相比较有17个蛋白在HS组表达量下调，而在SB与HS组比较却显著上升。除此之外，与空白组相比较有17个蛋白在HS组表达量上调，而在SB组与HS组比较却显著下降。逆转差异显著蛋白主要富集在Complement and coagulation cascades、Leukocyte transendothelial migration、Protein digestion and absorption、MAPK signaling pathway。

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摘要

缩略词(Abbreviation)

第一章 文献综述

1热应激

1．1热应激产生

1．2热应激奶牛抗氧化指标变化

1．3热休克反应

1．4热应激诱导细胞凋亡

2 p38MAPK信号通路

2．1 p38 MAPK的分子结构

2．2 p38MAPK激活

2．3 p38 MAPK的信号调节

2．4 p38M APK调控细胞凋亡

2．5 p38 MAPK抑制剂的发展

3蛋白质组学

第二章抑制p38 MAPK信号通路对热处理奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及细胞抗氧化指标的影响

1．材料与方法

1．1试验动物

1．2主要试剂

1．3主要仪器

1．4试验方法

2．测定指标及方法

2．1试验分组与处理

2．2 MTT法检测奶牛乳腺上皮细胞活力

2．3细胞流式术检测奶牛乳腺上皮细胞的凋亡

2．4奶牛乳腺上皮细胞内SOD活性检测

2．5奶牛乳腺上皮细胞内MDA含量检测

2．7数据统计与分析

3．结果

3．1奶牛乳腺上皮细胞的形态学观察

3．2奶牛乳腺上皮细胞的角蛋白-18鉴定

3．3 SB203580抑制剂对热处理下的奶牛乳腺上皮细胞活力的影响

3．4 SB203580抑制剂对热处理下的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响

3．5抑制p38 MAPK信号通路对热处理下奶牛乳腺上皮细胞内SOD的影响

3．7抑制p38 MAPK信号通路对热处理下奶牛乳腺上皮细胞内GSH-px的影响

4．讨论

参考文献

第三章激活和抑制条件下乳腺上皮细胞差异蛋白质的筛选

1材料与方法

1．1材料

1．2试剂

1．3仪器

1．4试验方法

1．5数据处理与分析

2结果与分析

2．1鉴定结果统计

2．2定量蛋白质组学的概述

2．3差异表达的蛋白

2．4蛋白质功能注释

3讨论

参考文献

全文结论

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致谢