基于DNA自组装生物传感器检测诺如病毒方法的建立

摘要

诺如病毒，又称诺瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV），是人类杯状病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中诺如病毒(Norovirus，NVs)属的原型代表株。它是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。感染者临床表现为呕吐、腹泻及头痛等症状。由于NVs进化迅速且缺乏合适的动物培养模型及体外细胞系统，目前尚还未有疫苗研制成功，且因其低致病剂量和高度稳定的特性，加大了其防治难度，极易造成大规模群体感染事件，由此引起的食品安全问题，不仅容易造成国际贸易壁垒，还给人们身体健康带来了极大的威胁，特别是在资源匮乏、医疗设备落后、专业医护人员短缺且环境卫生堪忧的地区，更是诺如病毒暴发的重灾区。 传统的诺如病毒检测方法主要有电镜法、免疫学法和反转录PCR法。虽然这些方法具有一定的有效性，但仍存在一些缺点。其中，电镜法灵敏度偏低且视觉干扰严重，免疫学方法操作繁琐、需低温保藏的抗原抗体和专业操作人员，反转录PCR法则会受到样品中大量PCR抑制剂的干扰，造成扩增效率低下。因此，仍需开发操作简单、准确快速的诺如病毒检测方法。 本研究在尽可能少用低温保藏条件的酶及抗原抗体，又能保证其灵敏度的条件下，以诺如病毒ORF1（Open reading frames1，ORF1）和ORF2之间的高度保守序列为检测靶点，基于纳米技术与DNA自组装生物传感器设计了两种信号放大方式，以期为开发简便快速、成本低廉的现场诺如病毒检测方法、制定统一的检测标准以及诺如病毒疫苗的研制奠定基础。 1.基于DNA与纳米材料自组装技术建立了一种新型的诺如病毒检测方法。以诺如病毒为检测对象，以其基因组ORF1和ORF2之间的高度保守序列为研究靶点，采用DNA自组装技术合成X-DNA作为捕获探针以提高靶DNA结合率，利用补骨脂素来加强捕获探针的稳定性并以琼脂糖凝胶电泳验证分析。通过DNA与纳米材料的自组装技术构建磁性纳米粒子增重球用于检测信号的放大，并对其进行了一系列表征分析，如透射电镜分析、X射线衍射分析、磁学性能分析及表面增强拉曼光谱分析，然后将反应溶液加入石英晶体微天平(Quartz crystal microbalance，QCM)并对实验参数进行优化，得到了最佳参数:捕获探针浓度1μM、反应温度37℃、反应时间3h。在最佳反应条件下，利用石英晶体微天平传感器来实现诺如病毒的定量检测。研究结果表明该法线性检测范围为1pM～1μM，线性相关系数为0.9956，检测限为0.15pM，实现了对靶DNA高效性、实时性的检测。 2.基于DNA纳米团簇与微悬臂梁传感器相结合建立诺如病毒的检测方法。利用DNA碱基互补配对原则，将单链DNA与X-DNA的粘性末端进行连接，自组装为DNA纳米团簇，优化了盐离子浓度、温度、时间、pH以及水源等自组装参数。以诺如病毒基因组ORF1和ORF2之间的高度保守序列为研究靶点，运用微悬臂梁传感器对诺如病毒进行实时性检测。通过制备的纳米金模拟微悬臂梁传感器，并与捕获探针连接验证实验的可行性，以靶点DNA为桥梁将DNA纳米团簇与捕获探针连接起来，实现检测信号放大。结果表明该法线性检测范围为10pM～1μM，线性相关系数为0.9909，DNA纳米团簇的加入不仅放大了检测信号，而且提高了检测方法的相关性，便于准确定量分析。 3.该研究初步建立了两种基于核酸探针检测诺如病毒的方法，为开发简便快速、成本低廉的现场诺如病毒病毒检测方法、制定统一的检测标准以及诺如病毒疫苗的研制奠定了基础，具有积极的实际应用价值。

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摘要

中英文缩略语索引

第一章文献综述

1 诺如病毒

1．1诺如病毒简介

1．2诺如病毒的分子生物学特征

1．3诺如病毒的研究现状

2．1传统检测方法

2．2基于生物传感器的检测

3选题依据

第二章基于磁性纳米粒子结合石英晶体微天平传感器检测诺如病毒

1．2仪器与设备

1．3试验方法

2实验设计

3 结果分析

3．1 捕获探针的合成及其稳定性分析

3．2磁性纳米粒子的合成及表征

3．3 QCM结合磁性纳米粒子检测诺如病毒

4讨论

5本章小结

第三章基于DNA纳米团簇结合微悬臂梁传感器检测诺如病毒

1．2仪器与设备

1．3试验方法

2实验设计

3结果与分析

3．1 X-DNA及DNA纳米团簇的合成及优化

3．2实验可行性分析

3．3微悬臂梁结合DNA纳米团簇检测诺如病毒

4讨论

5 本章小结

第四章未来与展望

全文结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文