TGEV感染对猪肠上皮细胞葡萄糖和精氨酸吸收影响机制的研究

摘要

猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是一种高度接触性肠道传染病，主要特征是引起仔猪呕吐，严重腹泻和致两周龄以下仔猪100％死亡率，给养猪业带来了巨大的经济损失。猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)是引起猪传染性胃肠炎的病原体。TGEV感染的主要靶细胞是肠道上皮细胞，同时肠道上皮细胞承担着吸收营养物质的功能，包括葡萄糖和精氨酸。之前的研究很少有报道TGEV感染对于肠道上皮细胞营养吸收的影响。猪肠上皮细胞系(IPEC-J2)是由猪空场细胞分化而来的细胞系，它为研究猪病毒感染和营养吸收提供了良好的模型。本研究主要探究了TGEV感染对于IPEC-J2细胞葡萄糖和精氨酸吸收的影响以及进一步的调控途径，研究内容主要分为三个部分: 1、TGEV对IPEC-J2细胞葡萄糖吸收影响的研究 TGEV感染肠道可能导致绒毛脱落，消化酶活性降低以及影响肠道正常的营养物质吸收。葡萄糖作为最基础的营养物质，它在肠道的吸收主要依赖于葡萄糖转运载体SGLT1和GLUT2。试验设为空白对照组和MOI=2剂量的TGEV感染组，试验结果显示:相对于空白对照组，TGEV感染在48h后增强了IPEC-J2细胞的葡萄糖吸收量(p＜0.05)，进一步的RT-PCR和Western-blotting试验发现TGEV感染在相对应的时间点导致葡萄糖转运载体SGLT1和GLUT2的mRNA水平不变，蛋白表达量升高。而且TGEV感染对IPEC-J2细胞的增殖和细胞活力没有显著的影响。综上的试验结果表明，TGEV感染通过增高葡萄糖转运载体SGLT-1，GLUT2的蛋白表达，提升了其对于葡萄糖的吸收能力。 2、EGFR调控IPEC-J2细胞葡萄糖吸收的初步探究 TGEV感染通过调控葡萄糖转运载体SGLT1和GLUT2来增强IPEC-J2细胞的葡萄糖吸收。已经有报道发现EGFR作为一种重要的信号通路分子，参与调控葡萄糖转运载体SGLT1和GLUT2的表达。本研究利用构建的EGFR慢病毒表达载体，通过在IPEC-J2细胞中干扰和过表达EGFR，分别探索了EGFR在未感染TGEV的IPEC-J2细胞和感染TGEV的IPEc-J2细胞中对于葡萄糖转运载体SGLT1和GLUT2表达的影响。试验结果表明在未感染TGEV的IPEC-J2细胞中，干扰EGFR的表达会降低SGLT1的蛋白水平(p＜0.05)，过表达EGFR则会升高SGLT1的蛋白水平(p＜0.05)，EGFR对于GLUT2的表达水平没影响。进一步的，当干扰SGLT1发现EGFR的蛋白水平也下降。在TGEV感染的细胞中，干扰和过表达EGFR试验发现EGFR的蛋白水平和SGLT1，GLUT2蛋白表达水平呈正向关系。另一方面，研究发现高浓度的葡萄糖可以促进TGEV的复制和释放。 3、TGEV感染对IPEC-J2细胞精氨酸吸收影响的研究 目前很少有文献报道过TGEV破坏靶细胞IPEC-J2营养吸收的机制，包括精氨酸。本研究采用高效液相色谱法(HPLC)检测发现TGEV(MOI=3)感染在48h后会降低IPEC-J2的精氨酸吸收量(p＜0.05)。进一步运用RT-PCR和western blotting分析发现，CAT-1的mRNA水平和蛋白表达水平在48h以后也发生了降低(p＜0.05)，而CAT-2的mRNA水平没有发生明显变化。另一方面，CCK8试验发现TGEV感染对细胞的活力没有显著影响，进一步深入探讨具体的机制。PKC蛋白激活剂PMA处理进一步降低了精氨酸吸收和氨基酸转运载体CAT-1的蛋白表达(p＜0.05);p-EGRR的干扰慢病毒载体和抑制剂AG1478处理则会缓解TGEV降低的精氨酸吸收水平和氨基酸转运载体CAT-1的蛋白表达。同样的，Caveolin-1的干扰慢病毒载体处理也会缓解TGEV降低的精氨酸吸收水平和氨基酸转运载体CAT-1的蛋白表达(p＜0.05)。说明p-EGFR，PKC，Caveolin-1信号蛋白参与到TGEV感染降低精氨酸吸收的过程中。同时试验还发现Caveolin-1与CAT-1的蛋白表达存在负相关性，而p-EGFR与CAT-1的蛋白表达则不具有相关性。

目录

声明

摘要

缩略语中英文对照

引言

第一章猪传染性胃肠炎病毒感染细胞的研究进展

1病原学

2生物学特征

3分子学特性

4致病机理

参考文献

第二章肠道葡萄糖和精氨酸吸收的研究进展

1肠道葡萄糖转运载体简介

1．1钠葡萄糖共转运载体1

1．2葡萄糖转运蛋白2

2调控葡萄糖转运载体的因素

2．1葡萄糖浓度

2．2蛋白激酶A和蛋白激酶C

2．3 MAPK信号通路蛋白对葡萄转运的调控作用

3肠道氨基酸转运载体简介

3．1阳性氨基酸转运载体1

3．2阳性氨基酸转运载体2

3．3阳性氨基酸转运载体3

3．4阳性氨基酸转运载体4

4调控肠道氨基酸转运载体的因素

4．1氨基酸底物浓度

4．2蛋白激酶C

4．3毒素和细胞因子

参考文献

第三章猪传染性胃肠炎病毒感染对肠上皮细胞葡萄糖吸收影响的研究

1材料与方法

1．1病毒与细胞株

1．2葡萄糖测定试剂盒检测IPEC-J2细胞培养基中葡萄糖含量的变化

1．3荧光定量PCR法检测SGLT1、GLUT2 mRNA的水平

1．4 Western-Blot蛋白印迹检测SGLT1、GLUT2蛋白的表达水平

1．6 CFSE试验检测IPEC-J2细胞增殖能力

2试验结果

2．3 TGEV感染对IPEC-J2细胞增殖和活力的影响

3讨论

参考文献

第四章EGFR调控IPEC-J2细胞葡萄糖吸收的初步探究

1材料与方法

1．1病毒与细胞株

1．3 Western-Blot蛋白印迹检测SGLT1、GLUT2蛋白的表达水平

1．7 EGFR干扰载体的构建和慢病毒包装

2试验结果

2．1 TGEV感染对于EGFR和p-EGFR蛋白的影响

2．2未感染TGEV的IPEC-J2细胞中，EGFR对于葡萄糖吸收的影响

2．3未感染TGEV的IPEC-J2细胞中，EGFR与SGLT1蛋白表达之间相互关系探究

2．4在TGEV感染的IPEC-J2细胞中，EGFR对于葡萄糖吸收的影响

2．5高浓度葡萄糖可以促进TGEV的复制和释放

3讨论

参考文献

第五章猪传染性胃肠炎病毒感染对肠上皮细胞精氨酸吸收影响的研究

1材料与方法

1．1病毒与细胞株

1．3 Western-Blot蛋白印迹检测CAT1、CAT2蛋白的表达水平

2．1 TGEV感染降低了IPEC-J2细胞的精氨酸吸收

2．2 TGEV感染对氨基酸转运载体CAT-1和CAT-2表达的影响

2．3 TGEV感染对细胞活力的影响

2．4 PKC参与调控精氨酸的吸收

2．5 p-EGFR参与调控精氨酸的吸收且与CAT-1的蛋白表达不存在相关性

2．6 Caveolin-1参与调控精氨酸的吸收且与CAT-1的蛋白表达存在正相关性

2．7精氨酸浓度可以影响TGEV复制

3讨论

参考文献

全文总结

致谢

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