黄芪对肠上皮细胞葡萄糖吸收的影响及其调控机制的研究

摘要

目的：
　　通过观察益气健脾中药黄芪对脾虚模型大鼠和Caco-2细胞葡萄糖吸收的改变以及葡萄糖运载蛋白SGLT1和GLUT2表达的影响，探讨黄芪改善脾虚证运化功能，改善营养物质吸收障碍的作用机理。
　　方法：
　　1、采用利血平皮下注射复制脾虚大鼠模型，模型建立成功后给予黄芪水提液灌胃治疗，观察黄芪对脾虚大鼠脾虚的一般表现症状以及葡萄糖吸收障碍的改善作用，并收集肠段进行病理学观察，收集肠粘膜提取蛋白和mRNA，对SGLT1和GLUT2进行转录和翻译水平上的观察，探讨黄芪的作用机理。
　　2、建立Caco-2细胞葡萄糖吸收检测方法。沿用前期研究考察的Caco-2细胞种植密度等，筛选处理Caco-2细胞的2-NBDG最佳孵育浓度和孵育时间。
　　3、采用系统溶剂分离法提取分离黄芪药效部位。测定黄芪药效部位得率，将得到的黄芪提取物在Caco-2细胞模型上进行促进细胞葡萄糖吸收药效筛选。筛选出促进Caco-2细胞葡萄糖吸收的黄芪有效提取部位。筛选出促进Caco-2细胞葡萄糖吸收的黄芪有效提取部位的最佳剂量。
　　4、在Caco-2细胞葡萄糖吸收模型上，在添加或不添加相关通路抑制剂情况下，观察其对Caco-2细胞葡萄糖吸收以及相关转运蛋白的调节作用。①加入黄芪正丁醇提取部位高、中、低（150 mg/L、100 mg/L、50 mg/L）三个剂量后，观察受试药对Caco-2细胞葡萄糖吸收的影响;②Western Blot和荧光定量PCR检测SGLT1和GLUT2的表达;③加入相应葡萄糖运载蛋白抑制剂，SGLT1抑制剂根皮苷PZ和GLUT2抑制剂根皮素PT，观察Caco-2细胞葡萄糖吸收的影响以及黄芪正丁醇提取部位对这一改变的影响作用;④Western Blot检测SGLT1和GLUT2蛋白表达。
　　5、在Caco-2细胞葡萄糖吸收模型上，加入GLUT2调节相关环节的抑制剂和激动剂，探讨黄芪正丁醇部位对GLUT2的调节机制。①加入U73122，观察Caco-2细胞葡萄糖吸收的改变以及黄芪正丁醇提取部位的影响作用;②观察PMA与黄芪正丁醇部位对Caco-2细胞葡萄糖吸收的影响;③Western Blot检测GLUT2蛋白表达。
　　结果：
　　1、成功复制了脾虚大鼠模型，发现造模组大鼠出现精神萎靡、腹泻便溏、活动减少等脾虚症状，模型组大鼠体质量及D-术糖排泄率较空白对照组减少。在体肠腔灌流显示脾虚大鼠葡萄糖吸收量减少，Western blot检测发现SGLT1和GLUT2蛋白表达下调。经黄芪水提液灌胃治疗后，脾虚大鼠一般状态好转，且体质量、尿D-木糖排泄率以及葡萄糖吸收量等指标均优于模型对照组。并且葡萄糖转运体SGLT1和GLUT2无论是蛋白水平还是基因水平都得到了改善。
　　2、建立了Caco-2细胞葡萄糖吸收检测方法:2-NBDG法。2-NBDG最佳孵育浓度为100μmol/L，最佳孵育时间为40 min。筛选出了促进Caco-2细胞葡萄糖吸收的黄芪有效部位:黄芪正丁醇提取部位，并筛选出其有效浓度为50mg/L-175mg/L。
　　3、考察了黄芪正丁醇部位3个浓度（50mg/L、100 mg/L和150mg/L）对Caco-2细胞葡萄糖吸收，筛选出最佳浓度为150mg/L。黄芪正丁醇部位3个浓度都可以促进Caco-2细胞葡萄糖吸收，且具有剂量依赖性。
　　4、黄芪正丁醇部位可以上调Caco-2细胞SGLT1和GLUT2蛋白和mRNA的表达，并具有剂量依赖性。
　　5、在细胞模型加入根皮苷PZ后，葡萄糖吸收量明显减少，且150 mg/L黄芪正丁醇提取部位可以明显改善这一状况;根皮素PT对无黄芪正丁醇部位作用下的细胞葡萄糖的吸收无明显影响作用，但明显减弱了黄芪正丁醇部位对Caco-2细胞葡萄糖吸收的促进作用。
　　6、在PZ负荷下，SGLT1的表达被明显的抑制，对GLUT2几乎无影响，在加入150 mg/L黄芪正丁醇提取部位后，SGLT1被抑制的情况有所好转，GLUT2的表达明显上调。在PT负荷下，GLUT2的表达被明显的抑制，对SGLT1无影响，在加入150mg/L黄芪正丁醇提取部位后，GLUT2被抑制的情况有所好转，但与空白组相差不大，SGLT1的表达上调。
　　7、在加入U73122情况下，黄芪正丁醇部位促进Caco-2细胞葡萄糖吸收以及GLUT2表达的作用被弱化;在加入PMA后，其发挥效用同黄芪正丁醇部位相似，都可以促进葡萄糖的吸收和GLUT2蛋白的表达。
　　结论：
　　1、脾虚大鼠存在葡萄糖吸收障碍的症状，这可能是由GLUT2和SGLT1表达下调导致的，黄芪可以通过调节这两个转运蛋白的表达来改善脾虚大鼠葡萄糖吸收障碍的症状。
　　2、黄芪正丁醇提取部位具有促进Caco-2细胞葡萄糖吸收的作用，这一作用主要是通过调节GLUT2和SGLT1表达来实现的。
　　3、GLUT2可能是在葡萄糖吸收障碍时发挥主要调节作用的蛋白，黄芪正丁醇部位可能主要是通过PKC-Ca2+-GLUT2这一通路促进Caco-2细胞葡萄糖吸收的。

目录

声明

论文说明

摘要

引言

文献研究

第一章 脾虚证营养物质吸收的研究

第一节 脾虚证研究概况

第二节 脾虚证与物质吸收代谢

第二章 葡萄糖转在肠道内转运吸收的研究进展

第三章 益气健脾中药的研究

第一节 益气健脾方药的概述

第二节 黄芪化学成分及药理研究概况

第四章 脾虚证营养物质吸收的前期研究

实验研究

第一章 体内实验

第一节 黄芪对脾虚大鼠葡萄糖吸收的影响

第二节 黄芪对脾虚大鼠肠道葡萄糖转运体表达的影响

第二章 体外实验

第一节 黄芪提取部位促进Caco-2细胞葡萄糖吸收药效筛选

第二节 黄芪正丁醇部位对Caco-2细胞葡萄糖转运体表达的影响

第三节 抑制剂负荷下黄芪正丁醇部位对Caco-2细胞葡萄糖吸收及转运体表达的影响

结语

一、黄芪对脾虚大鼠模型肠道内葡萄糖吸收的影响

二、黄芪提取分离以及促进Caco-2细胞葡萄糖吸收的药效筛选

三、黄芪正丁醇提取部位促进Caco-2细胞葡萄糖吸收的作用机制研究

四、结论

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢