刀鲚Foxl2基因和Cyp19a基因在卵巢及胚胎发育过程中的表达规律

摘要

近年来，随着刀鲚（Coilia nasus）人工繁殖技术的突破和市场需求的日益高涨，刀鲚正逐渐成为具有较高经济价值的特种养殖对象。但刀鲚群体个体间的卵巢发育差异极其显著，早期发育过程中的开口率低下等问题严重限制了刀鲚的规模化育苗技术的发展。Foxl2(叉头框转录因子L2)是脊椎动物进化过程中高度保守的卵巢分化基因，其在哺乳动物和鱼类中可以上调Cyp19a基因的表达，这种调节关系可能直接影响刀鲚的胚胎发育和性腺分化。Cyp19a（卵巢型芳香化酶）所编码的P450芳香化酶是一个重要的类固醇合成酶，能够促进雄激素向雌激素转化。本文克隆影响性腺发育Foxl2和Cyp19a基因，探讨Foxl2和Cyp19a在刀鲚组织特异性表达、不同性腺发育期卵巢和受精卵及胚胎、胚后发育阶段基因的表达模式，以确定在刀鲚发育过程中Foxl2对Cyp19a的转录调控作用来影响雌激素的合成从而对刀鲚性腺发育产生的影响，从分子领域研究影响刀鲚性腺发育的影响因素，为刀鲚规模化全人工繁育工作的早日实现提供技术支撑。 1.Foxl2和Cyp19a基因cDNA全长克隆和序列分析 刀鲚Foxl2基因cDNA全长为1635bp，其中5'端非编码区(5'-UTR)为37bp，3'端非编码区(3'-UTR)为659bp，开放阅读框（ORF）长度为939bp，编码了312个氨基酸。刀鲚Foxl2氨基酸序列与大西洋鲱（Clupea harengus）同源性最高，为78％。与虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、牙鲆(Paralichthys olivaceus)等其它鱼类同源性为69％～72％。刀鲚Foxl2基因与其他鱼类相似度很高，进一步证实了Foxl2进化上较高的保守性。 刀鲚Cyp19a基因序列全长为2007bp，其中5'端非编码区(5'-UTR)为83bp，3'端非编码区(3'-UTR)为346bp，开放阅读框(ORF)长度为1578bp，编码了533个氨基酸。刀鲚Cyp19a氨基酸序列与大西洋鲱Cyp19a基因同源性最高，为85％。此外，与稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)、金鱼（Carassius auratus）、鲤鱼（Cyprinus carpio）等鱼类的氨基酸同源性为69％～71％。刀鲚Cyp19a基因与其他鱼类Cyp19a比对结果显示保持较高的相似度，进一步证实了Cyp19a进化上较高的保守性。 2.刀鲚Foxl2和Cyp19a基因在胚胎发育阶段表达模式 在刀鲚胚胎发育时期，观察到Foxl2的总mRNA表达量的波动变化显著。其表达量大小顺序为多细胞期＞受精卵时期＞神经胚期＞第一次摄食后＞刚出膜期＞二细胞期＞肌肉效应期≈第一次摄食前＞原肠中期。 刀鲚Cyp19a在胚胎发育的10个时期中的mRNA表达模式存在波动:Cyp19a的mRNA表达量大小顺序为多细胞期＞二细胞期＞肌肉效应期＞出膜前期＞受精卵时期＞第一次摄食后＞刚出膜期＞神经胚期＞第一次摄食前≈原肠中期。 3.刀鲚Foxl2、Cyp19a基因在不同性腺发育期卵巢表达模式和组织特异性表达分析 使用RT-PCR分析刀鲚鳃，脑，肝，脾，肠，心脏，头肾，肾脏、肌肉和卵巢组织中Foxl2和Cyp19a的表达量的变化。实验结果显示，Foxl2基因在卵巢中高度表达，其次是肝、头肾和肠，此外在鳃，脑，肾脏和肌肉组织中检测到Foxl2的mRNA呈低表达水平，在肾脏中表达量最低。刀鲚Cyp19a在卵巢组织中表达量最高，远高于其他组织。其次在肝，肠，头肾和肌肉中检测到Cyp19a的低mRNA表达水平，但在鳃，脑和心脏组织中表达水平极低。 Foxl2基因在刀鲚卵巢mRNA表达模式整体呈下降趋势，从Ⅲ期逐渐下降到Ⅴ期。Cyp19a在卵巢中的mRNA表达模式与Foxl2的mRNA表达模式大致相同。在Ⅲ期较高水平的表达后，Cyp19a的mRNA表达水平升高到最高水平Ⅳ期，然后降至Ⅴ期的最低水平。 综上所述，Foxl2与Cyp19a作为卵巢发育和分化的关键基因，在刀鲚胚胎发育与调节性腺分化功能的过程中具有重要意义;Foxl2和Cyp19a于刀鲚组织分布中的表达模式具有很高的一致性，证明Foxl2可能参与Cyp19a的转录调控;Foxl2和Cyp19a基因在刀鲚卵巢组织中的高表达提示了两者在性腺发育中的关键作用，Foxl2参与了卵巢分化过程中Cyp19a的转录和启动，对卵巢发育起着关键作用。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1引言

2鱼类性腺发育过程

2．1鱼类性腺分化

2．2刀鲚卵巢发育的组织学分期

3鱼类性类固醇激素概述

3．1雌激素对鱼类卵巢及胚胎发育的作用

4鱼类性腺发育重要基因

4．1 Foxl2基因

4．2 Cyp19a基因

4．3 Cyp19a基因与Foxl2基因的关系

5本研究的目的及意义

第二章Foxl2和Cyp19a基因cDNA全长克隆和序列分析

1引言

2材料与方法

2．1实验材料

2．2实验方法

3结果分析

3．2刀鲚Foxl2和Cyp19a基因序列开放阅读框分析

3．3氨基酸及蛋白质二级结构分析

3．4核苷酸同源性分析

3．5Foxl2基因、Cyp19a基因的多重序列比对

3．6系统进化分析

4讨论

4．1刀鲚Foxl2基因序列分析

4．2刀鲚Cyp19a基因序列分析

第三章刀鲚Foxl2和Cyp19a基因在胚胎发育阶段表达模式分析

2．2实验方法

2．3数据处理

3实验结果

3．1 Foxl2基因在刀鲚胚胎及胚后发育表达模式分析

3．2 Cyp19a基因在刀鲚胚胎及胚后发育表达模式分析

4讨论

第四章刀鲚Foxl2和Cyp19a基因在不同性腺发育期卵巢表达模式和组织特异性表达分析

2．1实验材料

2．2实验方法

2．3数据处理

3实验结果

3．2刀鲚Foxl2和Cyp19a基因mRNA在不同性腺发育期卵巢表达模式

4讨论

4．2刀鲚Foxl2和Cyp19a基因mRNA在不同性腺发育期卵巢表达模式分析

全文结论

参考文献

致谢

攻读学位期间参加的科研项目和成果