乳酸菌肽聚糖的制备、结构及其生理功能研究

摘要

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)作为一种益生菌，由于其优良的物化特征和生理活性已成为广大学术研究者研究的热点。肽聚糖(peptidoglycan，PGN)作为乳酸菌细胞壁中的主要成分，其基本结构是由N-乙酰葡糖胺与N-乙酰胞壁酸通过β-1，4糖苷键相连接，并在重复的单体之间通过四肽链或者肽桥连结构成的多聚网状结构。据报道，PGN作为一种免疫增强剂，在诱导有关免疫调控因子的释放来刺激免疫系统发挥其抗感染、抗肿瘤等生物效应方面的研究已有进展，但其在益生功能的特性却有待进一步探索，因此本文选用体外肠道厌氧发酵的方法来研究其益生特性。 本论文将从植物乳杆菌(Lactobacilus plantarum D1501)和瑞士乳杆菌(L.helveticu MB2-1)中提取的肽聚糖作为研究对象，对其肽聚糖的分离纯化、结构特征和生理功能等进行了系统的研究。 1、本实验分离提取肽聚糖的过程为:菌体沉淀获取→菌体细胞壁的破碎→磷壁酸去除→脂肪去除→蛋白质的去除→透析纯化→离心冻干。来源于植物乳杆菌D1501的肽聚糖提取率约为41.43％,来源于瑞士乳杆菌MB2-1的肽聚糖提取率约为16.67％。 2、采用高效液相色谱法对分离提取后的肽聚糖进行纯度鉴定，结果证明，单一峰，峰面积为100％，说明提取的肽聚糖的可溶性部分的成分纯度为100％。分别采用考马斯亮蓝法、硫酸-苯酚法、Morgan-Elson法、香草醛法和钼酸铵法，提取的两组肽聚糖组分中蛋白质、中性糖、氨基己糖、脂肪和磷的含量，结果表明，来源于L.plantarum D1501和L.helveticus MB2-1的PGN蛋白质含量分别为35.56％和38.46％;中性糖含量分别为40.01％和30.77％;氨基己糖含量分别为19.33％和19.23％;脂肪含量分别为3.56％和9.74‰磷含量分别为0.08％和0.11％。 3、通过多种方法对肽聚糖进行结构分析。肽聚糖的全波长紫外扫描结果显示，D1501和MB2-1、D1501lysozyme和MB2-1lysozyme在280nm处有蛋白的特征吸收峰，在190～500nm的波长范围内无其他特征吸收峰，表明肽聚糖中无其他杂质。PGN样品的红外吸收光谱结果表明，来源于L.plantarum D1501和L.helveticus MB2-1的肽聚糖均具有PGN的特征吸收峰，并且在1070cm-1出现的C-O-C吸收峰可能代表了PGN样品中特殊的NAG-(β-1，4)-NAM结构。肽聚糖氨基酸分析结果所显示，来源于L.plantarumD1501和L.helveticus MB2-1的PGN的氨基酸组成含量近乎相同，主要的氨基酸组分是丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸，肽链的主要氨基酸成分是丙氨酸、赖氨酸与谷氨酸，甘氨酸与天冬氨酸作为肽桥的链接成分，由此可推断出，来源于L.plantarumD1501和L.helveticus MB2-1的PGN均是Lys型。PGN的1HNMR和MALDI-TOF/TOF质谱结果表明，结合氨基酸组分分析结果，可以推断出来源于L.plantarumD1501和L.helveticus MB2-1的PGN的单体可能结构。PGN的扫描电镜结果显示提取的肽聚糖结构完证，与菌体本身的形状相似，呈现杆状。在电镜图下，可以清晰看出冻干粉的颗粒是有许多个完整肽聚糖网状兜结构堆积而成。通过蛋白电泳检测提取的肽聚糖分子量约为68kDa。 4、体外抗氧化能力的实验结果表明，肽聚糖具有较强的超氧阴离子自由基清除活性，中等的DPPH自由基清除活性、羟基自由基清除活性和ABTS自由基清除能力，较弱的金属离子的螯合能力。肽聚糖样品的体外抗氧化能力的顺序依次为D1501Lysozyme＞MB2-1Lysozyme＞D1501＞MB2-1，其中DPPH自由基清除能力的顺序为D1501Lysozyme＞D1501＞MB2-1Lysozyme＞MB2-1，ABTS清除自由基能力的顺序为D1501＞MB2-1＞D1501Lysozyme＞MB2-1Lysozyme。经MTT法和吞噬中性红实验的测定，来源于L.plantarum D1501和L.helveticus MB2-1的肽聚糖纯品在25-300μg/mL的浓度范围内对小鼠巨噬细胞RAW264.7无毒性，并且能促进对细胞的吞噬能力，但是效果不明显。通过在倒置显微镜下观察LPS诱导RAW264.7炎症模型中PGN的活性，发现来源于L.plantarum D1501和L.helveticus MB2-1的肽聚糖对LPS诱导炎症有一定的修复作用。 5、利用荧光原位杂交(FISH)计数技术比较总菌群数、有益菌以及有害菌的数量和通过HPLC测定发酵过程中各种短链脂肪酸(SCFA)种类和含量的变化，可以得出肽聚糖对有益菌有一定的增值作用，对有害菌有一定的抑制作用。

目录

声明

论文说明

图形索引

表格索引

摘要

缩略词表

第一章文献综述

1 乳酸菌

1．1乳酸菌简介

1．2乳酸菌的生理特征

1．3乳酸菌细胞壁的生物学功能

2肽聚糖简介

2．1肽聚糖的组成

2．2肽聚糖的多样性

2．3肽聚糖的生物合成

2．4肽聚糖的分离提取

2．5肽聚糖的研究现状

2．6乳酸菌肽聚糖的应用前景和展望

3本文研究概述

3．1研究目的与意义

3．2主要研究内容

3．2主要研究思路图

第二章乳酸菌肽聚糖的分离提取

1材料和方法

1．1 实验材料

1．2实验方法

2结果与分析

2．1肽聚糖的常规组成成分分析

2．2肽聚糖的分离提取优化

3本章小结

参考文献

第三章乳酸菌肽聚糖的结构分析

1材料和方法

1．1 实验材料

1．2实验方法

2结果与分析

2．1 PGN的UV分析

2．2 PGN的HPLC分析

2．3 PGN的FT-IR分析

2．4氨基酸组分分析

2．5 核磁共振(NMR)分析

2．6 MALDI-TOF／TOF分析

2．7肽聚糖的扫描电镜结果

2．8蛋白电泳

3本章小结

参考文献

第四章肽聚糖的体外抗氧化及免疫活性研究

1材料和方法

1．1 实验材料

1．2实验方法

2结果与讨论

2．1肽聚糖的体外抗氧化活性

2．2肽聚糖的体外免疫活性

3 本章小结

参考文献

第五章肽聚糖的体外肠道益生功能研究

1材料和方法

1．1 实验材料

1．2实验方法

2结果与分析

2．1 肽聚糖对肠道菌群作用的差异

2．2肽聚糖对SCFA生成的影响

3本章小结

参考文献

全文结论

论文创新点

致谢