环境雌激素双酚A诱导山羊睾丸支持细胞自噬发生的研究

摘要

睾丸支持细胞(Sertoli cells，SCs)是雄性动物睾丸曲精细管内唯一的体细胞，可以维持和调节正常的生精过程，在精子发育成熟过程中具有十分重要的作用。SCs结构和功能的完整性对生精细胞增殖和成熟非常关键，其改变可导致生精细胞脱落和死亡。因此，SCs被广泛认为在睾丸微环境稳态维持中起着举足轻重的作用，微环境内一旦发生不利的变化，势必会影响SCs生物学功能，进而影响正常生精过程。因此，了解SCs稳态维持的机制对于深入认识精子发生过程具有重要的科学意义。自噬(Autophagy)是真核细胞通过溶酶体对自身亚细胞结构进行降解的生物学过程，调控细胞生长、分化以及维持内环境稳态的生物学行为。本研究旨在探讨SCs在环境雌激素双酚A(Bisphenol A，BPA)应激状态下自噬的发生及其可能的调控机制，为研究SCs在氧化应激状态下的生存机制提供新的依据，为进一步揭示精子发生机理提供理论参考。山羊作为重要的经济动物，具有生产肉、绒、奶等经济价值，而且山羊养殖业是我国的优势畜牧产业之一。 因此，本研究以山羊SCs为研究对象，首先建立细胞自噬双荧光报告系统，明确山羊SCs的细胞自噬活性;然后结合自噬激活剂雷帕霉素（Rapamycin，Rap）分析了山羊SCs在BPA诱导引起的氧化应激条件下，通过自噬途径实现自我保护的机制;最后运用过表达和RNAi技术研究了自噬关键因子ULK1对山羊SCs生物学特性以及细胞自噬活性的影响。主要的试验结果如下: 试验一、山羊睾丸支持细胞的培养与双荧光自噬报告载体的构建 本试验旨在体外分离培养获得山羊SCs，并建立检测其自噬活性的双荧光报告系统。首先采用联合酶消化和差异贴壁法分离纯化了山羊SCs，检测了其特异基因和蛋白的表达;然后将构建的双荧光报告载体pmCherry-EGFP-LC3转染山羊SCs，饥饿诱导处理后荧光观察法检测了自噬标记基因LC3的表达，qRT-PCR和Western-blot法分析了自噬基因Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达，透射电镜法观察了山羊SCs的自噬体，以监测山羊SCs的细胞自噬活性。结果显示，分离纯化的山羊SCs呈长柱状贴壁生长，胞体较大，两侧有2个或多个突起，折光性较强;FASL、Innhibin、ABP标记基因和波形蛋白呈强表达;饥饿处理后，荧光显微镜下可见绿色和红色荧光的顺利表达，证明了该载体的有效性;饥饿诱导处理后自噬基因Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平显著上升且有较多初始自噬体，表明自噬现象存在于山羊SCs。本试验构建的双荧光自噬报告载体可为进一步研究山羊SCs的自噬发生提供了有效的工具。 试验二、双酚A诱导山羊睾九支持细胞氧化损伤及细胞自噬发生的研究 本试验旨在研究BPA诱导处理条件下山羊SCs通过自噬途径实现自我保护的机制。首先采用不同浓度BPA（100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM）对山羊SCs进行处理，通过检测细胞活力、ROS水平等指标，筛选最适的氧化损伤浓度模型;然后采用qRT-PCR、Western-blot、JC-1和TEM等方法检测BPA处理后自噬标记基因和凋亡基因的表达及电镜下的自噬体;在此基础上，进一步通过添加自噬增强剂Rap观察其在BPA诱导处理后的山羊SCs中的作用。结果表明:相比低浓度组，山羊SCs在500μM浓度BPA处理时，细胞活力降低，线粒体膜电位（△Ψm）丢失，活性氧产生增加，凋亡相关基因BAX/BCL2的水平上升;自噬体形成增多及自噬相关标志物包括LC3，Beclin1，ULK1和Atg7的表达量增加。而添加自噬激活剂Rap后可以在一定程度上缓解BPA造成的损伤，清除细胞内ROS，恢复△Ψm，降低凋亡相关基因的表达。以上结果表明:BPA处理后，可能通过影响ROS的产生以及△Ψm的水平来诱导山羊SCs自噬的发生。 试验三、ULK1基因在双酚A诱导山羊睾丸支持细胞自噬发生中的研究 本试验旨在探讨自噬启动因子ULK1是否通过影响山羊SCs自噬进而影响山羊SCs相关生物学特性。首先化学合成了干扰ULK1基因的siRNA，构建了山羊ULK1基因的过表达载体，分别将其转染山羊SCs，检测了其特异标记基因的表达水平、细胞周期分布、细胞自噬和凋亡相关基因mRNA水平与蛋白的表达变化，并进一步通过透射电镜探讨了ULK1是否在BPA诱导山羊SCs自噬中发挥调控作用。结果显示:干扰ULK1后山羊SCs标记基因ABP、AMH、FASL、GATA4和Inhibition表达水平显著下降，自噬相关基因Beclin1、ATG5和ATG7的表达量显著下降，LC3和Beclin1的蛋白表达水平显著下降（P＜0.05）;但是过表达ULK1后山羊SCs的标记基因、自噬相关基因和蛋白水平呈上升的趋势(P＞0.05)。相比BPA单独诱导组和过表达UKL1+BPA诱导处理组，siRNA+BPA组山羊SCs形态结构上表现为染色质固缩和线粒体空腔明显增多，且自噬体的数量显著减少。以上结果表明，ULK1基因干扰和过表达均会影响山羊SCs的自噬活性以及细胞生物学特性，BPA诱导山羊SCs发生自噬，可能是通过影响ULK1来实现。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词

引言

参考文献

第一章睾丸支持细胞生物学特性及双酚A的雄性生殖毒性研究进展

1睾丸支持细胞的生物学特性及研究进展

1．1睾丸支持细胞的形态结构与分离培养

1．2睾丸支持细胞的生物学功能

2环境雌激素BPA对雄性生殖系统影响的研究

3展望

第二章细胞自噬及ULK1基因调控自噬的分子机制研究

1细胞自噬

1．1细胞自噬的概念

1．2细胞自噬的分类

2细胞自噬的检测方法

2．1基于静态的自噬体形态和自噬体标记蛋白LC3的检测

2．2基于动态的自噬潮分析

3．2 ULK1复合物的调控

4展望

第三章山羊睾丸支持细胞的培养与双荧光自噬报告载体的构建

1材料与方法

1．1试验材料

1．2主要仪器

1．3主要试剂

1．4主要溶液的配制

1．5试验方法

1．6数据统计与分析

2结果

2．1山羊SCs的分离培养与鉴定

2．2双荧光自噬报告载体pmCherry-EGFP-LC3的构建及鉴定

2．3饥饿诱导后山羊SCs自噬泡的形成

2．4饥饿诱导后山羊SCs标记基因和自噬相关基因的表达

3讨论

参考文献

第四章双酚A诱导山羊睾丸支持细胞氧化损伤及细胞自噬发生的研究

1．3主要试剂

1．4主要溶液的配制

1．5试验方法

1．6数据统计与分析

2结果

2．1 BPA对山羊SCs活力的影响

2．2 BPA对山羊SCs内ROS产生的影响

2．3 BPA对山羊SCs线粒体膜电位的影响

2．4 BPA对山羊SCs周期的影响

2．5 BPA对自噬和凋亡相关基因表达的影响

2．6 BPA对自噬和凋亡相关蛋白表达的影响

2．7 Rap对BPA引起细胞内ROS的影响

2．8 Rap对BPA引起细胞内线粒体膜电位下降的影响

2．9 Rap对自噬发生的影响

3讨论

参考文献

第五章ULK1基因在双酚A诱导山羊睾丸支持细胞自噬发生中的研究

1材料与方法

1．1试验动物

1．2主要仪器

1．3主要试剂

1．4主要溶液的配制

1．5试验方法

1．6数据统计与分析

2结果

2．1干扰ULK1对山羊SCs生物学特性的影响

2．2千扰ULK1对山羊SCs自噬和凋亡的影响

2．3 ULK1基因过表达载体的构建与鉴定

2．4过表达ULK1对山羊SCs生物特性的影响

2．5过表达ULK1对山羊SCs自噬和凋亡的影响

2．6 ULK1对双酚A诱导山羊SCs自噬体形成的影响

3讨论

参考文献

全文结论

创新点

攻读硕士期间发表的学术论文

致谢