弓形虫3种钙依赖蛋白激酶的克隆表达及对小鼠巨噬细胞功能的影响

摘要

弓形虫是一种能够感染几乎所有温血动物的胞内寄生性原虫，广泛寄生在各种哺乳动物、鸟类等，会引起动物和人的弓形虫病。弓形虫在全球范围都有流行，欧美、非洲地区呈现较高感染率。弓形虫感染会导致孕妇流产、动物死胎等，在人群中，对于免疫抑制病人、AIDS患者、器官移植病人的威胁极大;对于畜牧业发展也影响颇深，具有重要的兽医学和公共卫生意义。 多年来针对弓形虫的研究与防控工作不断进步，药物、疫苗研究颇具成效，为后续深层次研究奠定稳固基础。本文中，在体外环境中，将多种重组制备的弓形虫钙依赖蛋白激酶，与培养小鼠巨噬细胞进行作用，通过多种生理学及免疫学指标评价钙依赖蛋白激酶对宿主巨噬细胞的影响，为探究弓形虫致病机制提供了参考。 1.TgCDPK3、TgCDPK4A、TgCDPK9基因克隆与蛋白表达 RT-PCR成功扩增获得TgCDPK3(GenBank accession:XM_002370317.2.)、TgCDPK4A(GenBank accession:XM_018782284.1.)、TgCDPK9(GenBank accession:XM_018779775.1.)三种基因片段。将扩增产物回收纯化后，成功构建表达载体并获得重组蛋白。TgCDPK3基因ORF含1614bp，编码537个氨基酸的蛋白质，理论分子量大小为60.4kDa;TgCDPK4A基因ORF含1632bp，编码543个氨基酸的蛋白质，理论分子量大小为60.9kDa;TgCDPK9基因ORF含2001bp，编码666个氨基酸的蛋白质，理论分子量大小为75.6kDa。免疫印迹试验证明3种重组制备的蛋白抗原性良好。 2.rTgCDPK3、rTgCDPK4A、rTgCDPK93种重组蛋白与小鼠巨噬细胞的结合及对其增殖活性的影响 本部分试验证明了3种重组蛋白体外培养环境均与巨噬细胞相结合。利用CCK-8试剂盒方法检测发现，较高浓度的rTgCDPK3、rTgCDPK9重组蛋白抑制细胞增殖;低浓度rTgCDPK4A(5μg/mL)对细胞增殖起到一定促进作用，高浓度时则产生抑制作用。 3.rTgCDPK3、rTgCDPK4A、rTgCDPK93种重组蛋白对巨噬细胞吞噬功能及细胞凋亡的影响 试验数据表明，较低浓度的rTgCDPK3刺激使细胞吞噬强度提高，而高浓度时对细胞吞噬产生抑制，而不同浓度的rTgCDPK4A及rTgCDPK9蛋白刺激均使巨噬细胞吞噬能力加强。细胞凋亡数据显示，三种重组蛋白对细胞凋亡均产生较强的促进作用。 4.rTgCDPK3、rTgCDPK4A、rTgCDPK3种蛋白对巨噬细胞细胞因子分泌及NO合成的影响 结果显示，rTgCDPK3对TNF-α、IL-1β和IL-10分泌产生一定促进作用，而对TGF-β1分泌产生一定抑制作用;rTgCDPK4A作用后4种细胞因子的分泌均发生一定上调;rTgCDPK9蛋白刺激促进TNF-α、IL-1β的分泌，而抑制了TGF-β1和IL-10分泌。而3种重组蛋白对巨噬细胞的NO分泌均产生了显著促进作用。

目录

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论文说明

摘要

绪论

第一章弓形虫及弓形虫病

1 弓形虫概述

1．1 弓形虫生活史及感染途径

1．2弓形虫病危害

1．3流行病学

1．4检测方法

1．5防控研究

2 弓形虫引起的宿主免疫应答

2．1虫体入侵过程

2．2宿主抗弓形虫感染机制

2．3 弓形虫免疫逃避机制

3弓形虫研究展望

第二章钙依赖蛋白激酶研究进展

1钙依赖蛋白激酶的结构特征

2 CDPK蛋白生物学功能

第三章TgCDPK3、TgCDPK4A及TgCDPK9基因的克隆与表达

1．1试验材料

1．2试验方法

2．1 PCR扩增

2．2重组质粒pET-32a-TgCDPK3／pET-32a-TgCDPK4A／pET-32a-TgCDPK9的构建与鉴定

2．3重组蛋白的表达与纯化分析

2．4抗体效价测定

2．5 Western bolt分析

3 讨论

参考文献

第四章rTgCDPK3、rTgCDPK4A和rTgCDPK9与小鼠Ana-1巨噬细胞的结合试验及对细胞增殖的影响

1．1 试验材料

1．2试验方法

1．3数据处理

2 结果

2．1 rTgCDPK3、rTgCDPK4A和rTgCDPK9蛋白与Ana-1巨噬细胞的结合试验

2．2三种重组蛋白对细胞增殖的影响

3 讨论

参考文献

第五章rTgCDPK3、rTgCDPK4A、rTgCDPK9重组蛋白对小鼠Ana-1巨噬细胞吞噬、凋亡的影响

1．1 试验材料

1．2试验方法

1．3数据处理

2结果

2．1 三种蛋白对巨噬细胞吞噬功能的影响

2．2 rTgCDPK3、rTgCDPK4A和rTgCDPK9对Ana-1巨噬细胞凋亡的诱导作用

3 讨论

参考文献

第六章rTgCDPK3、rTgCDPK4A和rTgCDPK9对小鼠Ana-1巨噬细胞的细胞因子表达及NO分泌的影响

1．1 试验材料

1．2试验方法

2结果

2．1不同蛋白对4种细胞因子表达的影响

2．2不同蛋白刺激对细胞NO分泌水平的影响

3讨论

参考文献

结论与展望

致谢

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