刚地弓形虫4种能量代谢相关酶基因的克隆表达及对小鼠巨噬细胞功能的调节

摘要

弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种广泛寄生于人和温血动物有核细胞内的顶复门原虫(Apicom-plexan)，并可以引发人畜共患的弓形虫病（Toxoplasmosis）。弓形虫是一种细胞内寄生的机会性致病原虫，可以在免疫防御受损的个体中广泛散播，进而引发严重的疾病，例如弓形虫性脑炎、腹膜炎等疾病。另外，弓形虫病对畜牧业的危害也日益突出，弓形虫可以通过母畜垂直感染导致流产、死胎等不良妊娠，从而造成严重的经济损失。因此，近年来弓形虫病的诊断、治疗以及其致病机理的研究已经受到国内外学者的广泛重视。
　　目前，有关刚地弓形虫能量代谢相关酶对刚地弓形虫致病性的研究相对较少，对小鼠巨噬细胞免疫功能影响的研究几乎没有。本文选取了刚地弓形虫参与能量代谢过程的四种酶:磷酸甘油酸变位酶1(PGAM1)、磷酸甘油酸变位酶2(PGAM2)、柠檬酸合成酶1(CS1)和苹果酸脱氢酶(MDH)并对其相关基因进行克隆、表达及其对小鼠巨噬细胞功能调节进行初步研究。为进一步了解弓形虫能量代谢相关酶在其致病过程中如何发挥作用奠定了基础。另外，本文研究结果还表明这四种能量代谢相关的酶均具有良好的抗原性，为进一步研究其免疫保护性提供了实验依据。
　　1.TgPGAM1、TgPGAM2和TgCS1基因的克隆和序列分析
　　提取从小鼠中收集的弓形虫速殖子的RNA，mRNA用于合成cDNA，后者作为扩增弓形虫磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase，PGAM)、柠檬酸合成酶1(citratesynthase1，CS1)基因的模板。利用PCR技术扩增到TgPGAM1基因(GenBankaccession: XM_002371095.1)、TgPGAM2基因(GenBank accession: DQ457187.1)和TgCS1基因(GenBank accession: EF489424.1)。将扩增产物回收纯化，然后连接到pMD-19T克隆载体上。经酶切鉴定，选择阳性克隆进行序列测定和分析。结果证明，TgPGAM1基因的ORF含798bp，编码266个氨基酸，理论分子量29.26 kDa;TgPGAM2基因的ORF含795bp，编码265个氨基酸，理论分子量29.15 kDa; TgCS1基因的ORF含1665bp，编码555个氨基酸，理论分子量61.05 kDa。
　　2.TgPGAM1、TgPGAM2、TgCS1和TgMDH的原核表达和抗血清制备
　　为了获得重组蛋白TgPGAM1、Tg PGAM2、TgCS1和TgMDH，首先用限制性内切酶酶切出克隆的DNA片段，回收之后，亚克隆到pET32a载体上，之后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，重组表达质粒pET-28a-MDH为实验室构建好的。用IPTG诱导蛋白的表达。重组蛋白TgCS1和TgMDH均以包涵体形式存在，重组蛋白TgPGAM1、TgPGAM2存在于上清中。SDS-PAGE鉴定表达的重组蛋白，显示各蛋白条带的大小分别为:47kDa(PGAM1)、47kDa(PGAM2)、79kDa(CS1)34kDa(MDH)。将重组蛋白经过一系列的透析和复性，然后用纯化复性后的重组蛋白免疫大鼠，制备rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH抗血清。然后用Western Blot技术来验证抗血清的特异性。结果显示，表达的重组蛋白rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH，均能被感染弓形虫的鸡血清识别，说明自然感染情况下，4种酶能被宿主免疫系统识别，产生抗体。并且能检测到天然状态下这4种蛋白的存在，说明速殖子内存在天然的四种酶，表明重组蛋白有很好的抗原性。
　　3.rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH与小鼠巨噬细胞Ana-1的结合试验及对细胞增殖的影响
　　本部分研究旨在观察重组蛋白与小鼠巨噬细胞的结合情况及对小鼠巨噬细胞的增殖作用。将重组蛋白以20μg/mL的浓度加入细胞悬液中，放置细胞培养箱内培养2小时后收集细胞，应用免疫荧光抗体技术，在激光共聚焦显微镜下检测发现四种重组蛋白均能够与小鼠巨噬细胞Ana-1结合。为了检测重组蛋白rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH对小鼠巨噬细胞的增殖作用，将不同浓度的重组蛋白分别与细胞共作用24小时后，利用CCK-8法检测增殖结果。结果发现，4种重组蛋白显著降低细胞的增殖活性。
　　4.rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH对小鼠巨噬细胞Ana-1的吞噬、凋亡的影响
　　本部分研究进行了四种重组蛋白rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH对小鼠巨噬细胞的吞噬、凋亡的影响。分别用不同浓度的rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH与小鼠巨噬细胞共培养，用流式细胞术检测作用后对Ana-1细胞吞噬的影响及是否促进细胞的凋亡。结果显示，除了40和80μg/mL的rTgCS1降低对FITC-dextran的吞噬能力，Ana-1细胞经rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgMDH和5、10、20μg/mL的rTgCS1刺激后，吞噬FITC-dextran的能力均显著增加。不同浓度的rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgMDH和低浓度的rTgCS1均可以显著诱导Ana-1细胞发生晚期凋亡，高浓度的rTgPGAM1、rTgPGAM2和低浓度的rTgCS1、rTgMDH可以显著诱导Ana-1细胞发生早期凋亡。
　　5.rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH对小鼠巨噬细胞Ana-1的细胞因子表达及NO分泌的影响
　　本研究的目的是观察四种弓形虫重组蛋白rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH对小鼠巨噬细胞Ana-1的细胞因子表达及NO分泌的影响。用不同浓度的重组蛋白分别与小鼠巨噬细胞Ana-1共培养，用ELISA检测不同处理后的Ana-1细胞上清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、IL-10的表达，用总一氧化氮检测试剂盒检测NO的浓度。结果显示，高浓度的rTgCS1和不同浓度的rTgPGAM1、rTgPGAM2(20和40μg/mL的除外)和rTgMDH均可以促进细胞因子TGF-β1和IL-10的分泌。不同浓度的rTgPGAM1、rTgPGAM2、和rTgMDH（5μg/mL除外）均可以促进细胞因子IL-1β的分泌，不同浓度的rTgCS1均抑制促炎性细胞因子IL-1β的分泌。不同浓度的rTgPGAM1、rTgPGAM2均可以促进促炎性细胞因子TNF-α的分泌。与对照组相比，低浓度的rTgCS1和rTgMDH抑制TNF-α的分泌，高浓度的rTgCS1和rTgMDH促进细胞因子TNF-α的分泌。Ana-1细胞经过不同浓度的rTgPGAM1、rTgPGAM2作用后，细胞分泌的NO均显著减少。高浓度的rTgCS1和不同浓度的rTgMDH作用于Ana-1细胞后，细胞分泌的NO均显著增多。

目录

声明

论文说明

摘要

前言

第一章 弓形虫及弓形虫病

1 弓形虫分类与生活史

2 弓形虫病

3 防治措施

3．1 化学药物治疗

3．2 疫苗

参考文献

第二章 弓形虫病期间的免疫反应

1 入侵过程和细胞内的生态位

2 对弓形虫的先天免疫应答

3 对弓形虫的适应性免疫应答

3．1 CD4+T细胞的反应：启动和控制感染的机制

3．2 体液免疫是抵抗弓形虫病必不可少的

3．3 CD8+T细胞反应启动并控制寄生虫感染

4 控制弓形虫感染效应机制

4．1 一氧化氮抑制弓形虫复制

4．2 IFN-γ通过P47 GTP酶介导的保护

4．3 色氨酸退化作为防御机制的作用

4．4 TNF家族成员在对弓形虫的免疫中不可缺少

参考文献

第三章 TgPGAM1、TgPGAM2、TgCS1和TgMDH基因的克隆与表达

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 基因的RT-PCR扩增

2．2 质粒pMD19-T-TgPGAM1、pMD19-T-TgPGAM2和pMD19-T-TgCS1的鉴定

2．3 重组表达质粒pET-32a(+)-PGAM1、pET-32a(+)-PGAM2、pET-32a(+)-CS1和pET-28a(+)-MDH的构建和鉴定

2．4 重组蛋白的表达与纯化

2．5 Western Blot分析

3 讨论

参考文献

第四章 rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH与小鼠巨噬细胞Ana-1的结合试验及对细胞增殖的影响

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 rTg PGAM1／rTg PGAM2／rTgCS1／rTgMDH与Ana-1的结合试验

2．2 细胞增殖试验

3 讨论

参考文献

第五章 rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH对小鼠巨噬细胞Ana-1的吞噬、凋亡的影响

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 重组蛋白对细胞吞噬功能的影响’

2．2 重组蛋白对Ana-1细胞凋亡的影响

3 讨论

参考文献

第六章 rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH对小鼠巨噬细胞Ana-1细胞因子表达及NO分泌的影响

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 对抗炎性细胞因子TGF-β1和IL-10分泌的影响

2．2 对促炎性细胞因子IL-1β和TNF-α分泌的影响

2．3 对NO产生的影响

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢