乳中蛋白获取方法比较及猪乳N--链寡糖结构分析

摘要

现代养猪业生产中，为了提高母猪生产性能、仔猪出栏率及产仔舍利用率，通常需要对仔猪进行早期断奶。然而对仔猪过早断奶容易造成仔猪肠道健康损伤，消化系统功能紊乱、腹泻，严重时甚至造成仔猪死亡。如何减少早期断奶造成的仔猪肠道损伤一直是国内外研究探索的重点。而有研究发现将仔猪断奶日龄推迟可避免由于早期断奶应激造成的肠道柱状细胞激活诱发的黏膜损伤。之前对于人乳以及牛乳的相关报道中发现乳寡糖在调节肠道菌群和维持肠道健康方面有重要的作用，那么猪乳寡糖对解决仔猪早期断奶造成的肠道损伤可能也有积极作用。 乳寡糖的功能与其结构之间的关系密不可分，要想对乳寡糖的功能进行分析，首先需要精确解析它的结构。然而迄今为止针对乳寡糖的研究主要集中于人乳和牛乳，仅有的关于猪乳寡糖的报道也几乎都与游离寡糖相关，针对糖蛋白寡糖的研究几乎没有。而糖链分子具有多种生物学功能，并且糖蛋白的许多功能也已被证实是其分子上所连接的糖链分子具有的功能，因此对猪乳寡糖开展深入研究将会解决断奶仔猪肠道健康问题这一农业生产常见现象。 本研究以猪乳为主要研究对象，使用超高压液相色谱(UHPLC)结合MALDI-TOF对猪乳中可能存在的N-链寡糖组进行结构分析，比较猪乳不同泌乳期以及两个不同品种间N-链寡糖总量和结构的差别。 1.N-链寡糖组获取方法的比较 要对糖蛋白寡糖进行结构解析，首先需要获取糖蛋白，再将糖链从蛋白分子上释放下来。该过程包含了多个步骤和多种技术，需要进行优化选择。第一部分是针对糖蛋白分离沉淀方法的比较。本文分别测试了下列常用的蛋白沉淀方法:盐析法、氯仿-甲醇沉淀法、TCA（三氯乙酸）沉淀法和膜分离法。通过对所获得的蛋白冻干称重比较发现:使用40％TCA沉淀方法可以获得最大量糖蛋白。在此基础上，对几种沉淀方法获得的糖蛋白使用内切糖苷酶PNGase F进行酶切获得N-链寡糖，使用UHPLC进行检测，发现对40％TCA沉淀得到的糖蛋白进行酶切获得的N-链寡糖量同样是最多的。因此在接下来的实验中采用40％三氯乙酸(TCA)沉淀法获得糖蛋白。 2.猪乳糖蛋白N-链寡糖组结构分析 1)猪乳N-链寡糖结构分析 利用本实验室建立的寡糖结构解析方法平台对猪乳N-链寡糖组进行了详细的结构解析。首先利用PNGaseF将N-链寡糖组从糖蛋白解离下来，然后对N-链寡糖组进行荧光标记和UHPLC分离检测，并结合外切糖苷酶和GU（Glucose Unit，葡萄糖聚合度）值进行结构分析。同时将收集的单个液相峰组分进行MALDI-TOF检测。结果显示:猪乳N-链寡糖中共含有60种可能结构，收集峰组分进行MALDI-TOF检测后有17种结构被检测出来，其中12种得到二级质谱的验证。 2)不同品种、不同泌乳期N-链寡糖组含量的差异比较 本文对两个品种（大白和梅山）不同泌乳期（1天、3天、14天、21天）乳中N-链寡糖组结构（UHPLC峰谱图）进行了分析，结果表明:两个品种间乳N-链寡糖的结构种类没有差别，但是含量有差别。大白猪乳N-链寡糖的总量比梅山猪多，随着泌乳期的延长，两个品种猪乳的N-链寡糖组总量呈现下降趋势。而通过MALDI-TOF-MS结果分析发现:随着泌乳期的延长，岩藻糖基化寡糖含量下降，唾液酸化寡糖含量上升，而含高甘露糖的N-链寡糖总量维持在相对稳定水平，含岩藻糖唾液酸的N-链寡糖随着泌乳期的延长含量也呈上升趋势。

目录

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论文说明

摘要

缩写符号

第一章文献综述

1乳中寡糖的研究进展

1．1关于游离寡糖简介

1．2关于糖蛋白寡糖简介

2寡糖的结构分析

2．1N-链寡糖的解离

2．2糖链的衍生标记

2．3糖链的检测及结构解析

3猪乳N-链寡糖的生物学功能及研究现状

4本研究的目的及意义

第二章乳中糖蛋白获取以及不同方法酶切效率的比较

1仪器及材料

1．1乳样

1．2主要试剂

1．3仪器

2实验方法

2．1技术路线

2．2牛乳中糖蛋白的沉淀方法的比较

2．3对不同获得糖蛋白方法酶切效率的比较

3结果与讨论

3．1乳中糖蛋白粗提方法的比较

3．2不同沉淀方法获得的蛋白酶切后N-链寡糖的比较

5小结

第三章猪乳中N-链寡糖的结构测定

1仪器及材料

1．1乳样

1．2主要试剂

1．3外切糖苷酶

1．4仪器

2实验方法

2．1 HPLC检测猪乳中N-链寡糖含量以及预测N-糖结构

2．2 MALDI-TOF质谱检测

3结果与讨论

3．1猪乳N-糖基化寡糖结构分析

3．2相同品种不同泌乳期、不同品种同一泌乳期N-链寡糖含量比较

3．3猪乳N-糖基化寡糖中几种主要糖型含量的比较

4小结

全文结论

参考文献

附图

论文创新点

攻读硕士学位发表论文情况

致谢