灵菊七多糖的提取分离及其生物活性和发酵特性研究

摘要

多糖是广泛分布于植物、微生物和动物中的一种高分子化合物，尤其是在草本植物中含量较高。许多研究表明多糖具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、调节机体免疫力和肠道微生物等重要生物活性功能，已被作为保健品和饲料添加剂应用到制药业和饲料工业中。灵菊七是菊科菊三七属多年生草本植物，具有繁殖能力强、环境适应能力强等特性，是一种药食同源的植物，民间常用来泡茶，发挥其降低血糖和抗氧化等保健作用。灵菊七中的多糖资源尚未得到有效的开发利用，本论文以灵菊七茎叶为原料研究灵菊七多糖(GMPs)的提取工艺、分离纯化、理化性质和生物活性，为充分开发利用灵菊七资源及新型保健品和饲料添加剂的研制提供了理论依据。 主要研究内容包括以下四部分: 1.灵菊七多糖提取方法和提取工艺研究 比较了超声-酶辅助提取法、酶辅助提取法、超声提取法、热水提取法四种提取方法对GMPs提取率及多糖理化性质的影响。四种方法提取率分别为:超声-酶辅助提取法(7.13％)＞酶辅助提取法(6.99％)＞超声提取法(5.91％)＞热水提取法(4.52％)。超声-酶辅助提取法和酶辅助提取法GMPs的提取率差异不显著(P＞0.05)，但均明显高于超声法和热水提取法的提取率（P＜0.05）。 紫外-可见光谱和红外光谱结果表明四种多糖没有明显差异，都符合多糖的特征。高效凝胶滤过色谱分析发现，提取方法对GMPs的分子量有一定影响，酶辅助提取法和超声-酶辅助提取法能把大分子量的多糖降解成小分子量多糖，而且降解效果明显。超声提取法也可以降解GMPs，但是产物中会产生两种新的多糖结构。扫描电子显微镜观察发现四种多糖表面微观结构差异显著，热水提取法多糖表面致密紧实，酶辅助提取法多糖表面呈颗粒状，超声-酶辅助提取法多糖表面呈蜂窝状，超声提取法多糖呈管状碎片。扫描电镜观察结果与高效凝胶滤过色谱分析结果一致，即三种辅助提取方法都会对GMPs产生降解作用。 采用响应面法优化热水提取法提取GMPs，以多糖提取率为响应值，得出最优提取条件为:提取温度为91.7℃，液固比29.3∶1，时间4.06h，在最优提取条件下，GMPs提取率为5.56％，与预测值5.66％基本一致。响应面法优化纤维素酶辅助提取GMPs的最优条件为:提取溶液pH值为7.19，时间49.81min，加酶量为150.98(mg/g)。在此最优条件下，GMPs提取率为11.93％，与预测值12％基本一致。纤维素酶辅助提取法GMPs的提取率比热水提取法的提取率提高了2.15倍。 2.灵菊七多糖脱色工艺研究 利用大孔吸附树脂通过静态和动态吸附实验对GMPs进行脱色研究。结果表明，在8种树脂中D101大孔吸附树脂的脱色效果最好。D101大孔吸附树脂静态吸附条件为:吸附时间90min、温度35℃、pH值为7、多糖浓度为2mg/mL，在此条件下GMPs的脱色率、脱蛋白率和多糖保留率分别为84.88％、76.93％和81.17％;动态吸附条件为:D101大孔吸附树脂10mL湿法填装2.0cm×20cm层析柱、多糖浓度为2mg/mL、pH值为9、GMPs的加入量为1BV、洗脱速度为2BV/h，在此条件下，D101大孔吸附树脂对GMPs的脱色率、脱蛋白率和多糖保留率分别为90.37％、79.13％和92.51％。 对脱色和未脱色的GMPs进行了理化性质分析，紫外-可见光谱分析结果表明经过大孔吸附树脂脱色后GMPs的色素和蛋白吸光度值显著减小;红外光谱结果表明GMPs脱色前后红外光谱数据基本一致，二者多糖的特征基团仍然存在，糖苷键构型一致，说明大孔吸附树脂对GMPs结构没有产生影响;高效凝胶滤过色谱分析脱色前后GMPs分子量分布情况，结果表明GMPs所含的多糖种类没有改变，但是经过脱色后，多糖分离效果变得更好;扫描电镜观察发现经过脱色的GMPs表面变的松散。综上所述大孔吸附树脂适用于GMPs的脱色，并且脱色效果和多糖保留率均较高。 3.灵菊七多糖的分离纯化及结构研究 本实验对热水提取法获得的GMPs进行了分离纯化及结构研究。GMPs经过脱色、脱蛋白、DEAE-52纤维素柱色谱和SephadexG-100凝胶柱色谱分离纯化后，分离得到三种分子量均一的白色固体多糖GMP-0、GMP-1和GMP-2。紫外-可见光谱分析表明三种多糖均不含有蛋白和核酸等杂质;红外光谱分析表明三种多糖均含有多糖的特征基团，并都含有糖醛酸结构。高效凝胶滤过色谱法测定GMP-0、GMP-1和GMP-2三种多糖的分子量分别为5.97KDa、401KDa和45.1KDa;采用PMP衍生法分析了三种多糖的单糖组成，GMP-0主要由葡萄糖醛酸、葡萄糖和半乳糖醛酸组成;GMP-1主要由半乳糖醛酸和木糖及微量的葡萄糖组成。GMP-2主要由半乳糖醛酸、木糖及微量的葡萄糖和半乳糖组成。 4.灵菊七多糖生物活性及发酵特性研究 体外法研究了灵菊七多糖对DPPH、ABTS和·OH三种自由基的清除作用，结果表明GMPs和纯化后的多糖对三种自由基均有一定的清除能力，并且清除作用呈浓度依赖关系。GMPs的抗氧化活性与提取方法有一定的相关性，酶辅助提取法和超声-酶辅助提取法抗氧化活性高于热水提取法。经过分离纯化后的三种多糖抗氧化活性低于GMPs的活性，并且发现抗氧化活性与分子量大小有关，分子量越大抗氧化活性越弱。 利用Caco-2细胞为模型，考察GMPs和GMP-2对Caco-2细胞免疫因子分泌的影响。结果表明GMPs和GMP-2在低浓度(25μg/mL)和高浓度(200μg/mL)时均没有细胞毒性;两种多糖都具有较好的免疫调节作用，都能上调Caco-2细胞分泌产生IL-1β、IL-8、TNF-α和IFN-γ免疫因子的量，但效果均低于阳性对照LPS。GMPs和GMP-2刺激Caco-2细胞产生四种细胞因子的量有一定差异，GMP-2刺激Caco-2细胞产生IFN-γ水平明显高于GMPs，二者在浓度200μg/mL时产生IFN-γ的量分别是61.39ng/L和38.53ng/L;GMP-2刺激Caco-2细胞分泌TNF-α量高于GMPs，在浓度200μg/mL时产生量分别是41.16和39.13ng/L(P＞0.05);GMPs刺激Caco-2细胞产生IL-1β和IL-8的效果强于GMP-2(P＜0.05)，浓度在200μg/mL时二者IL-1β的产生量分别是3.37ng/L和2.61ng/L;GMPs和GMP-2浓度在200μg/mL时IL-8的产生量分别是186.9和154.15ng/L;免疫活性实验结果表明GMPs和GMP-2可以提高Caco-2细胞产生促炎症细胞因子的能力。 体外发酵法研究了GMPs的发酵特性。分别在发酵0、6、12和24h取样分析发酵产物的pH值、GMPs的分子量变化、短链脂肪酸种类及含量。发酵24h后提取发酵液中菌群的DNA，采用16S rDNA高通量测序分析GMPs对肠道微生物组成的影响。结果表明:GMPs在发酵过程中可以使发酵液的pH值由8.0降低至5.92。GMPs样品中有3种多糖含量随着发酵时间延长逐渐降低，表明GMPs可以被肠道微生物利用。发酵24h短链脂肪酸含量达到最大，可以产生乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸四种短链脂肪酸，其中乙酸含量显著高于阳性对照FOS组（P＜0.05）。GMPs可以调节肠道菌群变化，在门分类水平上拟杆菌门和变形菌门的丰度上升、厚壁菌门的丰度下降。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章文献综述

1灵菊七简介

2多糖简介

2．1多糖的提取方法

2．2粗多糖的脱色方法

2．3多糖分离纯化方法

2．4多糖结构研究方法

2．5多糖生物活性及其在饲料中的应用

2．6多糖发酵研究

3本研究的目的、意义及主要研究内容

3．1研究目的、意义

3．2主要研究内容

第二章灵菊七多糖提取方法和提取工艺研究

第一节不同方法提取的灵菊七多糖理化性质分析

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

第二节热水法提取灵菊七多糖工艺条件优化

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

第三节纤维素酶辅助提取灵菊七多糖工艺条件优化

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

本章小结

第三章灵菊七多糖脱色工艺研究

1材料和方法

1．1实验材料

1．2实验方法

2结果与分析

2．1 GMPs色素最大吸收波长确定的结果

2．2大孔吸附树脂对GMPs脱色作用结果

3讨论

4本章小结

第四章灵菊七多糖的分离纯化及结构研究

1材料和方法

1．1实验材料

1．2实验方法

2结果与分析

2．2 SephadexG-100凝胶柱色谱洗脱结果

2．3多糖纯化组分高效凝胶滤过色谱图

2．4单糖组成分析结果

2．5紫外-可见光谱

2．6红外光谱

2．7扫描显微电镜

3讨论

4本章小结

第五章灵菊七多糖生物活性及发酵特性研究

第一节灵菊七多糖抗氧化活性研究

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

第二节灵菊七多糖对Caco-2细胞分泌细胞因子的影响

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

第三节灵菊七多糖发酵特性研究

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

本章小结

全文结论

论文创新点

工作展望

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表和录用的论文