奈米非肽聚乙二醇修饰的初步研究

摘要

蛋白质聚乙二醇化技术可以有效地降低药物蛋白质免疫原性，延长其循环半衰期并改善其药代动力学、药效学等性质，因此成为近些年的研究热点。PEG修饰技术对氨基修饰的作用位点主要发生在α-NH2和ε-NH2，本文采用5kDa的单甲氧基聚乙二醇(mPEG5000)为原料，自制树脂-Nemifitide做为PEG修饰的偶联载体，使mPEG选择性地与肽末端α-NH2发生偶联反应，减少了反应副产物的量，简化了分离纯化的过程。
　　 本论文研究内容如下：
　　 1、以Rink Amide MBHA树脂为反应起点，针对微波反应功率、温度、升温时间、维持时间四个主要影响氨基酸结合率的因素、采用正交实验对困难氨基酸Fmoc-Hyp-OH、Fmoc-(4-F)Phe-OH的微波反应条件进行优化，确定最佳反应条件为：功率600W、温度60℃、升温时间2min、维持时间4min。采用微波辅助合成，合成反应时间从近2h缩短至8min，对树脂-Nemifitide的手工合成及微波辅助合成进行比较，粗肽得率从57.2％提高到80.4％。
　　 2、以mPEG5000为原料，利用N-羟基琥珀酰亚胺活化法、氯化亚砜活化法、二甲亚砜-醋酐(DMSO-Ac2O)活化法分别对mPEG端羟基活化进行研究，制备了不同类型的mPEG修饰剂分别为mPEG-SS、mPEG-苯甲醛、mPEG-OCH3CHO。mPEG-SS在偶联反应的切割过程中，95％TFA导致酯键断裂。mPEG-苯甲醛衍生物，与肽的偶联过程中引入了苯甲醛结构，生物安全性低于mPEG-OCH3CHO。mPEG-OCH3CHO做为修饰剂与树脂-肽偶联，经MALDI-TOF-MASS和SDS-PAGE结果证明，可以成功修饰Nemifitide。
　　 3、分别采用单因素实验和正交实验考察了pH值、反应时间、反应温度、mPEG-OCH3CHO投入量各因素对修饰反应转化率的影响，建立了mPEG修饰小肽的的最佳反应条件为：反应温度为室温，pH=6，反应时间5h，mPEG-OCH3CHO投入量为树脂-Nemifitide游离氨基的12倍。
　　 4、采用反相液相色谱(RP-HPLC)、分子筛色谱初步建立了mPEG-Nemifitide分离纯化的方法。修饰产物混合体系中的组分可得到较好的分离效果。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示mPEG-Nemifitide在4.1kDa～6.5kDa之间出现单条带。飞行时间质谱(MALDI-TOF-MASS)检测结果进一步证实修饰产物的分子量呈正态分布，符合聚乙二醇分子量分布特性，其最高分子量为5500，与mPEG-Nemifitide理论分子量相符。