组成型纤维素酶高产菌的选育及酶学性质研究

摘要

纤维素是自然界中年产量最大的可再生能源，将其充分利用对于解决人类社会的环境污染和日益严峻的能源危机有着重大的现实意义。利用纤维素酶来催化水解木质纤维素具有反应条件温和、无副产物和污染少等优点，但存在生物质水解速度慢，酶用量大等缺点。因此开发新型高效的纤维素酶具有重要的意义。
　　 本研究内容主要包括：(1)筛选组成型纤维素酶高产菌株并对产酶条件进行优化；考察不同碳源及诱导物的影响，初步确定酶系组成；(2)纤维素酶的纯化及性质研究。
　　 本研究从富含纤维素的土样中筛选得到一株组成型纤维素酶产生菌LC-9，结合Biolog微生物自动鉴定仪和16S rDNA序列分析，该菌株鉴定为Bacillussubtilis。通过发酵产酶条件优化，确定菌株B.subtilis LC-9最佳生长和产酶温度均为35℃，培养基最适初始pH为5.0～5.5；摇瓶装液量为50 mL/250 mL，转速为200 r/min。优化后发酵培养基最佳成分为(g/L)：KH2PO43.0，MgSO4·7H2O0.3，蔗糖5.0，蛋白胨15.0，玉米浆30 mL/L。经30 h～35 h培养后内切纤维素酶活力可达6.22 IU/mL，比优化前提高了40倍。该菌株产酶发酵周期短，无需纤维素类物质的诱导，推测为一株新型高效组成型纤维素酶高产菌株。
　　 各种碳源对B.subtilis LC-9发酵产纤维素酶的影响表明，可溶性碳源对该菌株所产的各种纤维素酶均有一定促进作用，乳糖能显著促进内切纤维素酶和滤纸酶活力，纤维二糖在发酵早期可明显促进木聚糖酶活力，推测菌株LC中可能主要存在两种纤维素酶的成分：β-1，4-内切纤维素酶和木聚糖酶。
　　 从B.subtilis LC-9发酵液中提取分离β-1，4-内切纤维素酶。发酵上清液经过不同pH缓冲作为流动相的两步DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换，获得了电泳纯的蛋白酶，该酶亚基分子量29 KDa。纯酶比活力达1650.67 IU/mg，纯化倍数为542.98，回收率为61.91％。该内切纤维素酶催化羧甲基纤维素钠水解反应符合米氏方程规律，该酶底物专一催化能力较强，米氏常数Km为0.0423 g/L，Vmax为135.85 mg/min。
　　 B.subtilis LC-9的β-1，4-内切纤维素酶具有良好的pH稳定性。在较宽的pH范围(pH4.0～11.0)内均维持较高活力，最适反应pH为5.0，最适反应温度为65℃，25℃以下保存酶活基本保持不变。不同浓度的Cu2+、Co2+均可促进该内切纤维素酶活力，中、低浓度的Fe2+对酶活有抑制作用，而高浓度的Fe2+可促进酶活，10 mmol/L浓度的EDTA对酶活无显著影响，推测该酶很可能为非金属离子纤维素酶。
　　 本研究筛选得到的组成型纤维素酶高产菌B.subtilis LC-9，产β-1，4-内切纤维素酶活力高，产酶无需诱导，发酵周期短，纯化工艺简便，酶的底物专一性很强，单位酶活力高，具有很大的开发潜力。