复方中药紫龙金治疗肾细胞癌的实验研究

摘要

目的: 1.体外观察复方中药紫龙金(zilongjin，ZLJ)对肾癌细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用。 2.通过中药血清药理学方法，观察含ZLJ血清对肾癌细胞的增殖抑制作用。 3.探讨ZLJ对裸鼠人肾癌移植模型的抗肿瘤作用。 方法: 采用 MTT(Thiazolyl blue，噻唑兰)比色法分别检测不同浓度的ZLJ(0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.3mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml)分别作用24h、48h、72h对人肾癌Ketr-3细胞和人脐静脉内皮细胞ECV304的抑制作用，计算半数抑制浓度(IC50)；并用倒置显微镜观察细胞形态学的改变；采用软琼脂集落生长实验观察ZLJ对Ketr-3细胞集落形成的抑制作用；分别收集不同浓度(0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml、1.0mg/ml)ZLJ处理48h的Ketr-3细胞，采用流式细胞仪(FCM)用AnnexinV-FITC-PI(Propidium Iodide,碘化丙啶)双标记法检测ZLJ作用48h后Ketr-3细胞早期凋亡率及死亡率；应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测ZLJ对Ketr-3细胞bcl-2 mRNA及bax mRNA表达的影响；采用血清药理学方法取得含ZLJ大鼠血清，并用WST-8比色法检测含药血清对Ketr-3细胞的生长增殖的影响；体外培养人肾癌Ketr-3细胞，建立裸鼠人肾癌移植瘤模型，随机分为空白对照组，NS对照组，ZLJ组，采用人工灌胃方式灌服ZLJ及NS，ZLJ组每日灌服一次，每次1.3g/kg，2ml/只，连续灌服2周，每周测量瘤体大小，观察肿瘤生长趋势，用组织病理切片检测肿瘤生长状况及裸鼠肝、肾组织生长情况。 结果: MTT结果显示：与对照组比较，ZLJ对Ketr-3细胞具有较强的抑制作用(P<0.01)，且呈时间和剂量依赖性，随时间的延长和浓度的增加而增强，而对ECV-304的作用无明显差异(p>0.05)，作用48h后Ketr-3细胞IC50为45μg；形态学观察：ZLJ处理细胞后，倒置显微镜下见细胞皱缩变圆，体积缩小，随着药物浓度增大和作用时间的延长，细胞表面逐渐凸起小膜泡(即凋亡小体)不断地脱落悬浮于培养液中，活细胞数量明显减少，死亡细胞增多，而对照组细胞生长活跃，核分裂像多见，细胞异型性明显；FCM检测结果：ZLJ作用48h后，Ketr-3细胞早期凋亡率及死亡率高于对照组(P<0.01)；RT-PCR方法检测结果：不同浓度ZLJ作用于Ketr=3细胞48h后，bax基因表达上调，而bcl-2基因表达下调，并随着药物浓度的增加其对基因表达的影响增强；血清药理学实验：各组细胞作用48h后，在5％血清含量时抑制率无明显差异(P>0.05)，在10％与20％血清含量时，C组、D组细胞抑制率高于A组(P<0.01)，B组与A组无明显差异(P>0.05)；在50％血清含量时，A、B、C、D组细胞均表现出明显的生长抑制状态(p>0.05)；荷瘤裸鼠灌胃2周后，各组肿瘤平均体积：空白对照组1382.5±116.3 mm3，灌服NS组1324.1±103.5mm3，灌服ZLJ组854.3±96.7mm3；ZLJ组与空白组、NS组之间差异明显(p<0.01，n=8)，NS组与空白组之间无明显差异(P>0.05，n=8)，组织学观察肝、肾等重要脏器形态学上未见明显改变。 结论: ZLJ通过诱导细胞凋亡抑制Ketr-3细胞体外增殖与裸鼠移植瘤生长；含ZLJ大鼠血清能抑制Ketr-3细胞体外增殖，与直接加入法体外增殖抑制实验结果基本一致。

目录

论文说明:缩略词表

声明

第一部分复方中药紫龙金对人肾癌Ketr-3细胞体外增殖与凋亡的影响

前言

材料与方法

1材料

2方法

结果

讨论

结论

第二部分血清药理学方法研究含ZLJ大鼠血清对人肾癌Ketr-3细胞体外增殖的抑制作用

前言

材料与方法

1材料

2方法

结果

讨论

结论

第三部分复方中药紫龙金对裸鼠人肾癌移植瘤生长增殖的影响

前言

材料与方法

1材料

2方法

结果

讨论

结论

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参考文献

综述 血清药理学实验方法的研究进展

攻读硕士学位期间发表学术论文题目

致谢