紫龙金克服肿瘤细胞多药耐药性的机制和全氟壬酸对大鼠肝脏免疫毒性的研究

摘要

1、中药紫龙金克服肿瘤细胞多药耐药性的机制
　　 复方中药紫龙金(Zilongjin,ZLJ)是一种新型的抗癌中药,在临床上广泛应用于胃癌,结肠癌,乳腺癌等常见肿瘤的治疗,具有良好的临床抗癌疗效。多药耐药性的产生是导致化学药物治疗肿瘤失败的主要原因之一,目前已经成为临床肿瘤治疗中的主要障碍。ZLJ与肿瘤多药耐药性的关系尚未见报道,为拓展其用途,本研究观察中药ZLJ对于克服肿瘤多药耐药性的作用机制。
　　 我们选择具有显著耐药性特征的两对细胞株,人乳腺癌耐药细胞MCF-7/DOX和人口腔上皮癌耐药细胞 KBV200以及对应的敏感细胞株MCF-7、KB作为研究载体,ZLJ处理这两对细胞。MTT法检测ZLJ对细胞增殖的影响,结果显示:敏感细胞和耐药细胞对ZLJ的IC50值相近,依次为0.69±0.055 mg/ml和0.65±0.030 mg/ml,0.61±0.078 mg/ml和0.59±0.035 mg/ml,表明MCF-7/DOX和KBV200对ZLJ均没有交叉耐药性。流式细胞仪检测细胞周期的变化,罗丹明123荧光以及活性氧自由基变化,结果显示ZLJ对敏感和耐药细胞均有S期阻断作用,高浓度ZLJ处理后罗丹明123荧光强度有所升高,认为其有微弱的逆转耐药性作用,ZLJ处理后检测活性氧自由基没有变化。ZLJ分别与多柔比星 DOX和长春新碱VCR合用,可以明显地增加DOX和VCR的活性。Western blot方法检测相关蛋白的变化,随着时间的增加,MCF-7/DOX中耐药蛋白P-糖蛋白和抑癌基因蛋白 p53的表达逐渐降低,同时,在高剂量下,凋亡标志蛋白PARP出现切割。
　　 研究表明:复方中药ZLJ抑制耐药细胞MCF-7/DOX和KBV200增殖,对其没有交叉耐药性；ZLJ的抑制作用与阻断细胞S期DNA的合成,诱导细胞凋亡以及降低P-gp的表达有关。
　　 2、Kupffer细胞(KC)介导的全氟壬酸对大鼠肝脏免疫毒性的研究
　　 近年来,PFNA的应用越来越广泛,自然界中野生动物及环境介质中检测到的PFNA含量也逐渐升高。对PFNA的研究较多的是肝脏毒性,生殖与发育毒性,而对PFNA的免疫毒性的研究相对较少。
　　 KC是肝血窦内的吞噬细胞,具有吞噬、分泌、参与免疫等功能。KC通过调节应激及代谢相关的酶积极参与肝细胞的解毒功能。本论文就是研究KC介导的PFNA对大鼠肝脏免疫毒性的机制。主要结论如下:
　　 选择雄性SD大鼠作为研究对象,分别单独暴露PFNA组,以及同时暴露PFNA和KC抑制剂GdCl3(每隔两天注射一次)14天后,单独暴露组肝脏组织中炎性因子TNFα、IL-1β的分泌量显著增加,而PFNA和GdCl3共同暴露组TNFα、IL-1β的含量与对照组水平相当。同时,活体暴露后灌流法分离的KC中TNFα、IL-1β的基因表达水平也明显升高。此外,体外PFNA单独暴露KC后,TNFα、IL-1β的分泌水平也显著性上升。
　　 单独暴露PFNA及同时暴露PFNA和GdCl3后分离肝细胞,分析其基因表达情况。结果表明,在PFNA存在的条件下,KC的失活使得基因PPARα的表达升高,PPARα下游基因CPT-1,CTE-1,MTE-1均出现相似的趋势。体外单独暴露PFNA以及PFNA分别和IL-1β、TNFα共同暴露,结果表明单独暴露组基因PPARα表达显著升高,其共同暴露组的表达却显著性下降,表明KC是在PFNA的刺激下产生大量的IL-1β和TNFα,而IL-1β和TNFα可以抑制PPARα的表达。TNFα与IL-1β的趋势相似,共培养的结果也证实了这一点。
　　 转染含有PPARα启动子的质粒,分别用TNFα和IL-1β处理,结果显示处理组PPARα表达水平均下降,这说明TNFα和IL-1β能在分子水平上抑制PPARα启动子的表达。转染NF-κB质粒,分别用PFNA,WY14643,TNFα和IL-1β处理,结果表明TNFα和IL-1β处理组的NF-κB表达显著性增加,表明KC在PFNA的刺激下,产生IL-1β和TNFα,IL-1β和TNFα是通过刺激NF—κB通路的高表达来抑制PPARα的表达,这一过程并非靠PFNA本身的抑制作用。用NF-κB的亚基p65和PPARα启动子共转染,用TNFα和IL-1β处理,共转染组的PPARα表达水平明显下降。同时,用NF-κB抑制剂处理原代肝细胞后,PPARα表达水平明显升高,这些结果都证实了TNFα和IL-1β刺激NF-κB通路的高表达。
　　 综上所述,PFNA暴露后,KC在介导肝脏毒性方面发挥了重要的作用,通过分泌大量的IL-1β和TNFα,从而激活NF-κB的表达,来抑制PPARα及相关基因表达的下降,从而导致脂类在肝脏中的累积并产生毒性效应。