肝癌特异性多靶点慢病毒载体的构建、鉴定及其在肝癌基因治疗中的应用

摘要

目的：探讨survivin-CMV特异性启动子调控的多靶点慢病毒对肝癌细胞生长的影响。
　　 方法：RT-PCR扩增anti-AFP-scFv，测序鉴定，双酶切连接，获得pMD2G-anti-AFP-scFv质粒。针对已经筛选确定的IGF1R基因干扰有效序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与质粒pPRIME连接得到pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R质粒。RT-PCR扩增survivin-CMV肝癌特异性启动子，测序鉴定，与双酶切的质粒pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R连接，得到质粒sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R。用sur-CMV-pPRIME-miR30-shR-NA-IGF1R，psPAX2，pMD2G-anti-AFP-scFv共转染293T细胞，经过病毒空斑纯化，包装成慢病毒，测定病毒滴度。Westernblot检测IGF1R表达，竞争抑制实验检测构建慢病毒的靶向性，TUNEL检测细胞凋亡，Western-blot检测细胞周期相关蛋白cyclinD1,cyclinE，P27，CyclinB1的表达，CCK-8法检测细胞生长。
　　 结果：成功构建肝癌特异性启动子调控的慢病毒AFP-sur-CMV-PRIME-mi-R30-shRNA-IGF1R;滴度为4.58×109PFU/ml;AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R抑制了肝癌细胞IGF1R表达，与对照组相比，表达明显下降（P＜0.05），竞争实验显示该慢病毒高效表达抗人AFP单链抗体的基因，TUNEL检测细胞凋亡显示AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R凋亡指数为24.36±4.12，与对照组比较，能够抑制肝癌细胞株HepG2的生长（P＜0.05），与AFP-PRIME组及sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R比较，AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R组有更多的细胞发生凋亡，之间差异有统计学意义（P＜0.05）。CCK-8结果显示，目的慢病毒载体能够抑制肝癌细胞株的生长，与细胞周期蛋白密切相关，细胞周期相关蛋白cyclinD1，cyclinE表达降低（P＜0.05），P27表达增高（P＜0.05），而CyclinB1的表达无明显变化（P＞0.05）。
　　 结论：1本次实验构建的慢病毒载体具有良好的靶向性，能够在肝癌细胞株中特异性表达抗人AFP单链抗体，而在正常肝细胞株不表达。2构建的慢病毒载体体外细胞试验证实anti-AFP-scFv与miR30-shRNA-IGF1R的shRNA之间有协同作用。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

前言

第一部分 慢病毒载体的构建及鉴定

材料和方法

1 材料

2 方法

结果

讨论

结论

第二部分 慢病毒载体对人肝癌HepG2细胞株的生物学影响

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

论文图片

慢性毒的发展　综述

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

临床培训小结

致谢