增强型肿瘤特异性人源载体的构建及其对肝癌基因治疗的研究

摘要

肝癌是最常见且死亡率较高的恶性肿瘤之一。肝癌临床上手术切除率低，对放、化疗敏感性差，转移情况普遍，预后极差，迫切需要新的治疗方法。近年来随着人们对肝癌分子病理机理研究的不断深入，为正在兴起的肝癌基因治疗提供了理论依据，促进了人们用分子手段治疗肝癌的探索性研究。 基因治疗面临的最关键的问题就是基因导入系统即载体问题，理想的载体应具有安全性好、特异性强、转染率高和操作简便等特点。目前在肝癌的基因治疗实验中使用最多的是病毒载体系统，包括腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、SV40病毒载体等；非病毒载体系统主要是脂质体、裸DNA。目前使用的载体各有其优缺点，尚无完美的理想载体，比较常用的病毒性基因治疗载体普遍存在遗传不稳定、容量小、安全性差及免疫原性等缺陷，而非病毒载体存在靶向性差等。夏家辉院士于1991年在进行新生儿染色体群体调查时发现一家系中2个携带双随体小染色体而表型正常的个体，创新性地提出小染色体可作为一种理想的基因治疗载体，并以此为基础，构建了人源基因载体-pHrneo，随后利用该人源基因载体将人凝血因子Ⅸ的cDNA导入D、G组染色体短臂靶位点，通过实验证明能有效、稳定表达人凝血因子Ⅸ。但该载体用于肿瘤的基因治疗，其体内转染效率低限制了其临床应用。 本研究是利用构建的人源基因载体作骨架进行肝癌的基因治疗，将具有肿瘤特异性启动活性元件和肿瘤自杀基因插入到人源基因载体内，转染肝癌病人的骨髓单核细胞，筛选得到的阳性细胞克隆经病人的肝门静脉注射，以期通过细胞融合，与体内肝细胞和肝癌细胞融合；如阳性的骨髓单核细胞克隆与体内正常肝细胞融合，肿瘤特异性启动元件在正常肝细胞不能启动下游肿瘤杀伤基因的表达，正常肝细胞不会受到损害；如阳性的骨髓单核细胞克隆与体内肝癌细胞融合，肿瘤特异性启动元件将启动下游肿瘤杀伤基因的表达，将肝癌细胞杀死，达到治疗肝癌的目的。 本研究中，构建具有肿瘤特异性的杀伤载体及检测此载体的作用效果。首先利用PCR扩增不同长度的具有肿瘤特异性启动活性的启动子一人端粒酶催化亚基hTERT启动子片段，与pEGFP-N1质粒连接构建成hTERT-GFP载体，体外转染端粒酶阳性的肿瘤细胞和端粒酶阴性的人成纤维细胞，以期证明克隆的hTERT启动子具有肿瘤特异性；为了提高基因的表达，本研究中将SV40和(或)CMV增强子分别加入该启动子片段的前面，构建不同组合的质粒载体，通过pEGFP-N1、荧光素酶体系筛选在各肿瘤细胞中明显提高外源基因表达的最优组合。同时将自杀基因CD、TK构建成融合基因，连至经优化的增强子、hTERT启动子下游，并一起连接至我室构建的人源基因载体形成肿瘤杀伤载体，体外转染肝癌细胞，经RT-PCR、HPLC、MTT检测CD／TK基因的表达和对肝癌细胞的杀伤效果。在动物实验方面采用先将肝癌细胞接种到裸鼠皮下致瘤，再用肿瘤杀伤载体与体内转染用脂质体混合直接瘤内注射观察瘤体的生长情况；另外先将肿瘤杀伤载体体外转染肝癌细胞，再把转染后的细胞接种到裸鼠皮下，观察瘤体的生长情况来检测我构建的肿瘤杀伤载体对肝癌的杀伤作用。 发现经PCR扩增的hTERT启动子片段(275bp)连至GFP载体后在肿瘤细胞中能特异性表达，而在人成纤维细胞中未见表达，但活性较弱；在肝癌细胞中发现CMV增强子能明显提高hTERT介导的GFP、荧光素酶基因表达；成功扩增了CD、TK基因并建成融合基因，构建了由CMV增强子、hTERT启动子介导、CD／TK融合基因、人源基因载体组成的肿瘤杀伤载体，体外转染肝癌细胞，经RT-PCR、HPLC证明CD／TK基因能在肝癌中表达，并能将前体药物5-Fc转化成毒性药物5一Fu；MTT证实肿瘤杀伤载体对肝癌细胞有明显毒性。动物实验结果发现肿瘤的大小在转染肿瘤杀伤载体的细胞组明显小于对照组，证明构建的肿瘤杀伤载体对肝癌细胞有较强的杀伤作用，为拟定的肝癌基因治疗设想提供了一个理想的载体。

目录

文摘

英文文摘

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主要实验仪器、试剂以及耗材

前言

第一章:肿瘤特异性启动子的克隆及其部分活性研究

第二章用原核增强子提高肿瘤特异性启动子hTERT介导的外源基因表达

第三章肿瘤特异性杀伤载体的构建

第四章肿瘤特异性杀伤载体对肝癌细胞杀伤作用的研究

结论

参考文献

基因治疗靶向研究中常用的组织特异性启动子

致谢

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