ERK蛋白磷酸化在体外培养星形胶质细胞缺氧/复氧后活化及增殖中的作用

摘要

目的：本课题通过研究体外培养星形胶质细胞(astrocyte，AC)缺氧/复氧后增殖、凋亡及阻滞ERK蛋白磷酸化后增殖和凋亡的变化，从而探讨ERK蛋白磷酸化在AC缺氧/复氧后反应性增殖中的作用，为临床上调控脑卒中后AC反应性增殖，预防AC增殖失控所致胶质瘢痕的形成提供理论支持。
　　方法：取新生24h内SD(Sprague Dawley)大鼠大脑皮层组织，参照McCarthy等的方法进行AC原代培养，经差速贴壁法提纯后，置于细胞培养箱内培养。7～8天后，细胞融合明显，采用摇床震荡法提纯细胞后，进行细胞传代培养，传至第4代时，细胞自然纯化，采用神经胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)免疫荧光鉴定AC，阳性率97％以上时符合实验要求。采用特异性ERK磷酸化阻滞剂UO126为阻滞剂，终浓度为10μmol/L，均在缺氧前30min加入，无阻滞剂组加入等量培养基。将纯化鉴定后的AC分为正常对照组(C组)、正常阻滞剂组(C+M组)、缺氧/复氧组(H/R组)、缺氧/复氧阻滞剂组(H/R+M组)。用三气培养箱给予95％N2、5％CO2造成细胞缺氧，建立AC缺氧/复氧模型。选取正常组及缺氧8h然后复氧0h，4h，8h(分别标记为H8，H8R4，H8R8)的细胞应用Western-blot(免疫印记)检测ERK蛋白磷酸化水平及UO126对其磷酸化的影响。选取正常组及缺氧8h然后复氧0h，8h，12h，24h，48h(分别标记为H8，H8R8，H8R12，H8R24，H8R48)的细胞，分别应用MTT法分别测定细胞活力、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine，Brdu)及GFAP双染色观察细胞的增殖情况、ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)法测定肿瘤坏死因子-α(Tumor NecrosisFactor-α，TNF-α)的分泌情况。选取正常组及缺氧8h然后复氧0h，8h，12h，24h(分别标记为H8，H8R8，H8R12，H8R24)的细胞，采用AnnexinV/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)双染法应用流式细胞仪测定细胞凋亡率。采用SPSS16.0统计软件包进行数据分析。
　　结果：1 GFAP鉴定结果：GFAP+DAPI(4'，6-diamidino-2-phenylindole)免疫荧光双标显示双阳性细胞的胞质为绿色，细胞核为蓝色，结果显示98％以上为阳性细胞，符合实验要求。2.Western-blot半定量检测：非缺氧组ERK蛋白磷酸化水平较低，缺氧组细胞缺氧/复氧后各时间点ERK蛋白磷酸化水平较非缺氧组升高(P<0.05)。阻滞剂组ERK蛋白磷酸化水平较无阻滞剂组下降。3.MTT法检测细胞活力：缺氧组细胞随时间延长，AC活力较非缺氧组降低的趋势更加明显，复氧12h后差异有统计学意义(P<0.01)；阻滞剂组较无阻滞剂组细胞活力下降，复氧12h后差异有统计学意义(P<0.05)。4.Brdu免疫荧光检测AC增殖：非缺氧组细胞未见染色，缺氧组细胞缺氧期未见染色，复氧后随时间延长细胞核染色逐渐增多(P<0.05)。阻滞剂组细胞复氧后各时间点较无阻滞剂组细胞核染色减少，随时间延长，组间差异逐渐显著，复氧48h时差异有统计学意义(P<0.01)。5.ELISA法检测TNF-α分泌：非缺氧组给予阻滞剂后较非缺氧无阻滞剂组比较差异不明显，缺氧组各时间点TNF-α的分泌较非缺氧组升高(P<0.05)，随时间延长趋势逐渐明显，阻滞剂组与非阻滞剂组比较TNF-α的分泌增加，随时间延长，差异更加显著，在复氧24h后差异有统计学意义(P<0.01)。6.AnnexinV/PI双染测定细胞凋亡：非缺氧组细胞给予阻滞剂后凋亡率较无阻滞剂时无差异，缺氧组各时间点与非缺氧组比较细胞凋亡率升高(P<0.05)，随时间延长，升高趋势逐渐明显，给予UO126后细胞的凋亡率升高更加显著，在复氧24h时差异有统计学意义(P<0.01)。
　　结论：1.ERK蛋白磷酸化水平升高促进星形胶质细胞缺氧/复氧后反应性增殖。
　　2.ERK蛋白的磷酸化促进星形胶质细胞缺氧/复氧后反应性增殖可能与其改善星形胶质细胞缺氧/复氧后细胞活力，抑制其凋亡发生及减轻炎症活化程度有关。