RNA干扰沉默AATF基因对急性髓系白血病细胞系U937细胞增殖、凋亡的影响

摘要

目的：检测抗凋亡转录因子(Apoptosis Antagonizing Transcription Factor，AATF)在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)细胞系、AML患者以及正常人骨髓细胞中的表达情况;构建靶向干扰AATF基因表达的载体，经电穿孔转染获得稳定沉默AATF的人急性髓系白血病细胞系;体外观察AATF基因沉默对其细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响，体内验证下调AATF对白血病细胞成瘤的影响，并探讨其可能机制，为急性髓系白血病基因靶向治疗提供实验和理论依据。
　　方法：(1) Trizol法从AML细胞系（U937、THP、HEL、HL60、KG-1细胞），20例初诊AML患者以及健康志愿者的骨髓标本中提取总RNA，使用逆转录试剂盒反转录成cDNA，利用Primer5.0软件设计针对AATF和GAPDH的特异性引物，通过逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)及实时定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction，Q-PCR)检测AATF mRNA表达情况，并通过相对定量公式2-ΔΔCt计算出其相对表达水平，Western Blot检测AATF蛋白表达。(2)根据GeneBank数据库提供的AATFmRNA序列，以228～249、303～324、443～464位序列作为RNA干扰位点，合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸，克隆至经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的pSilencer3.1人H1启动子干扰载体中，测序鉴定正确后，经电穿孔将3个重组载体（pSA-1、pSA-2、pSA-3）转染人白血病U937细胞系，G418(500mg/L)有限稀释法持续筛选2周后，扩增获得稳定表达的细胞系;Q-PCR、Western Blot分别检测稳定转染细胞系的AATF mRNA和AATF蛋白表达。(3)以细胞形态学、AnnexinV/7-AAD双标记流式细胞术等检测靶向下调AATF后U937细胞凋亡情况;CCK8法检测其增殖的变化。裸鼠背部皮下接种AATF靶向沉默的U937细胞和对照组细胞，观察成瘤情况，比较两组肿瘤体积和重量，以评价下调AATF表达对体内肿瘤生长作用。(4) Q-PCR检测AATF靶向沉默的U937细胞中Bax、Bim、Bcl-xL mRNA表达的变化。
　　结果：1.初诊AML患者和多种AML细胞系均高表达AATF，其中U937细胞表达更高。2.测序证明AATF干扰序列及读码框完全正确。pSilencer3.1-H1neo-AATF shRNA稳定转染细胞AATF mRNA表达下调，AATF蛋白表达量下降(P＜0.05)。3.AATF基因沉默的U937细胞24h后出现核破碎、核边聚，凋亡小体等典型的凋亡细胞的特征形态学表现;AnnexinV/7-AAD标记的阳性细胞升高，细胞早期凋亡率为（5.68±1.03）％，高于非特异shRNA对照组的（1.89±0.52）％，而晚期凋亡率为（1.58±0.37）％，也高于非特异shRNA对照组的（0.37±0.28）％，AATF基因下调可增加U937细胞凋亡、抑制细胞增殖，对裸鼠成瘤生长有明显抑制作用（P＜0.05）。4.AATF靶向沉默的U937细胞中Bim表达显著增加(P＜0.05)，而Bax、Bcl-xL表达无明显变化。
　　结论：1.AATF在急性髓系白血病细胞系和原代急性髓系白血病细胞中均高表达。2.成功构建出靶向干扰AATF基因的shRNA表达载体，并筛选出稳定干扰AATF基因表达的人急性髓系白血病细胞系—U937细胞系。3.体内外研究证实，下调AATF可抑制U937细胞系增殖，促进细胞凋亡增加，从而抑制肿瘤生长。

目录

研究生个人简介

缩略词表

摘要

前言

第一部分 AATF在急性髓系白血病细胞系及其原代细胞中表达研究

材料和方法

结果

第二部分 稳定干扰AATF基因表达的人急性髓系白血病细胞系的筛选

材料和方法

结果

第三部分 AATF基因沉默对U937细胞生物学行为的影响

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

AATF生物学功能研究进展和意义 综述

攻读硕士学位期间发表学术论文

临床培训小结

致谢

声明

论文审阅认定书