JNK信号传导通路在星形胶质细胞缺氧/复氧后的作用研究

摘要

目的：本课题通过研究分析缺氧/复氧后体外星形胶质细胞(Astrocyte，AC)的凋亡及通过特异性抑制剂阻断JNK信号传导通路后对凋亡的影响，从而探讨JNK信号转导通路在AC缺氧/复氧后凋亡中的作用，为临床上缺血性脑卒中的神经保护治疗，抑制神经细胞凋亡，改善卒中预后等提供理论依据。
　　方法：利用新生24小时内的SD(Sprague Dawley)大鼠，取脑皮层新鲜脑组织，参照McCarthy等的方法进行星形胶质细胞（Astrocyte，AC）原代培养，经差速贴壁法提纯后，置于细胞培养箱内培养。7-8天后传代，传至第3代，细胞自然纯化，采用神经胶质纤维酸性蛋白(glia fibrillary acid protein，GFAP)免疫荧光鉴定AC，97％以上为阳性细胞，符合实验要求。将AC分四组:1.正常对照组（N组）;2.正常抑制剂SP600125组（U组）;3.缺氧/复氧组（H/R组）;4.缺氧/复氧抑制剂组(H/R+U组)。采用特异性JNK磷酸化抑制剂SP600125，终浓度为10μmol/L，均在缺氧前30min加入，无阻滞剂组加入等量培养基。用三气培养箱以95％N2、5％CO2造成细胞缺氧，建立AC缺氧/复氧模型并记录缺氧时间。缺氧8小时后分别调节温度37℃及32℃，开始记复氧时间。每组设复氧4h、6h、12h、24h4个时间点。将各组分别以MTT方法测定细胞活力，蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测JNK及p-JNK蛋白表达情况，ELISA法检测TNF-α含量，采用AnnexinV/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)双染法应用流式细胞仪测定细胞凋亡。采用SPSS16.0统计软件包进行数据分析。
　　结果：1.体外纯化培养AC及GFAP鉴定结果:AC传至3代后，细胞突起较多而长，胞体较大而扁，细胞形态不规则，胞核多偏于一侧，多为椭圆形，GFAP+DAPI(4'，6-diamidino-2-phenylindole)免疫荧光双标显示双阳性细胞的胞质为绿色，细胞核为蓝色，结果显示97％以上。2.MTT法检测细胞活力:(1)随复氧时间延长细胞活力明显下降，与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.05);(2) H/R+U组较H/R组细胞活力增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。3.Western-blot半定量检测结果:(1)各组间 JNK水平差别无统计学意义(P＞0.05);(2) H/R组p-JNK缺氧复氧后表达量增多，并于复氧12h达到高峰，复氧24h开始下降;与N组比较差异有统计学意义(P＜0.05);(3) H/R+U组与H/R组相比p-JNK被特异性抑制剂抑制，p-JNK表达量下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。4.ELISA TNF-α检测:(1)未给予缺氧复氧处理的N组与U组TNF-α水平无显著变化;(2)H/R组缺氧后随复氧时间延长TNF-α水平明显升高，与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.05);(3)用SP6000125阻断JNK通路后，H/R+U组TNF-α水平较N组升高，较H/R组降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。5.流式细胞仪检测AC凋亡结果:(1)缺氧复氧后AC的凋亡增加，N组比较凋亡率增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。(2)给予抑制剂阻断JNK通路后，H/R+U组AC与H/R组比较凋亡减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论：1.缺氧/复氧后AC出现不同程度的凋亡，并且AC活力也出现不同程度的下降。2.AC在缺氧复氧后，JNK信号通路较正常组有不同程度的激活。3.SP600125特异性阻断JNK信号转导通路后能够减轻AC在缺氧/复氧过程中的活性下降，并发挥其抗凋亡作用。4.SP600125阻断JNK通路后，AC在缺氧复氧过程中的炎性细胞反应受到了一定程度的抑制。

目录

研究生简介

缩略词表

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 JNK信号转导通路与缺血性脑卒中关系的研究进展

攻读硕士学位期间发表学术论文

临床培训小结

致谢

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论文审阅认定书