桑根腐病病原菌米根霉分离鉴定及催化蚕蛹油制备生物柴油

摘要

桑树病害种类很多,发生条件各异,症状也不相同,通常将桑树病害分为桑病毒病,桑真菌病和桑细菌病。而桑树根部病害主要有桑真菌病,桑细菌病和桑根结线虫病。目前,发现对桑树具有致病性的真菌有:桑蜜环菌属(Armillaria)、裂褶菌属(Schizophyllum)、桑卷担菌属(Helicobasidium)、根霉属(Rhizopus)和镰霉菌属(Fusarium)。
　　本研究从一株桑树根部分离获得对桑树具有致病性的菌株,暂命名为TY.GF1。在32℃,该菌在PDA培养基上首先长出白色气生菌丝,呈棉絮状,菌落无定形,随后菌落转为灰黑色,病原菌2～3d内长满整个平板。培养3d后观察病原菌产生小刺球形孢子囊,有假根,孢子囊球形或近球形,深褐色,孢囊孢子呈卵形或球形或近似球形,大小不等,淡褐色。同时应用核糖体18SrDNA和ITS区基因分子方法进一步鉴定。利用真菌通用引物扩增了出18SrDNA和ITS区基因片段,经测序,大小分别为1805bp和627bp。将获得的基因序列分别提交到GenBank数据库,并在NCBI中blast,选取同源性较高的序列构建系统进化发育树。结合形态特征和基因序列分析,将TY.GF1菌株鉴定为米根霉。
　　通过罗丹明B平板对米根霉的发酵液的快速鉴定,确定TY.GF1野生菌株能够产生脂肪酶。本研究通过不同碳源(葡萄糖、麸皮、果糖、红糖、蔗糖、桑粉、淀粉、麦芽糖和大豆油)、氮源(蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸钠、玉米粉和硫酸铵)、诱导物(大豆油、麻油、蓖麻油、橄榄油、芥花籽油、葵花籽油、蚕蛹油和菜籽油)、温度(25～45℃)、pH值(4～9)、产酶时间(12～96h)、表面活性剂(曲拉通X-100、吐温-20、吐温-80、聚丙二醇和十二烷基硫酸钠)的单因素筛选,选取8个可疑因素利用Placket-Burman作重要因素筛选,确定了麦芽糖、蛋白胨和芥花籽油为对全细胞酶活影响较大的重要因素,并用Box-Behnken确定各因素最佳响应值,得出最适反应体系为:麦芽糖2.08g/L,蛋白胨21.58g/L,芥花籽油12.73g/L,吐温-800.1％(v/v),NaNO31.2g/L, KH2PO41.2g/L,MgSO4·7H20,温度35℃,摇床转速130rpm。在该条件下,全细胞最大酶活预测值为278.154U/g,验证值为272.5U/g。
　　对脂肪酶的前提基因和成熟基因进行了扩增和测序,分别获得了片段长度为1101bp和810bp的片段,将获得的前体序列提交到GeneBank,登录号为JN689988。序列分析表明,无内含子,分别编码366个氨基酸和269个氨基酸,成熟脂肪酶的结构域在SDGGKVVAAT序列上。理化性质预测分析表明,成熟脂肪酶的分子式为C1335H2056N350O396S7,分子量为29569.5,理论等电点为8.14,消光系数为1.163～1.175;发现前体脂肪酶的分子式为C1758H2729N469O547S10,分子量为39507.4,理论等电点为7.15,消光系数为1.123～1.132。且二者都是疏水的。
　　在叔丁醇介质体系下,TY.GF1全细胞催化蚕蛹油制备生物柴油最佳反应条件为35℃,转速为130rpm,蚕蛹油6.5g,全细胞添加量为0.8g,水含量为油重的3％,甲醇1.05g,叔丁醇体积比为1.5:1,反应24h后,生物柴油得率可达到80％以上。在无助溶剂反应体系中,虽然采用了分步添加甲醇的方式来避免甲醇对全细胞的负面影响,但全细胞在重复使用过程中稳定性较差,在第五次的时候,全细胞酶失活,而在叔丁醇介质体系中,反应九次之后,全细胞相对酶活力仍然能达到67％。

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Contents

第1章 绪 论

1.1 桑树根部病害研究进展和选题意义

1.2 人工接种苗期致病性测定方法

1.3 病原菌检测技术研究进展

1.4 根霉脂肪酶

1.5.生物柴油

1.6 脂肪酶其他工业上的应用

1.7 本研究主要内容

第2章 桑根腐病病原菌的分离及鉴定

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第3章 米根霉全细胞酶活的优化

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

第4章 脂肪酶序列的扩增及分析

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

第5章 米根霉全细胞催化蚕蛹油制备生物柴油

5.1 实验材料与方法

5.2 实验方法

5.3 实验结果

5.4 讨论

结 论

参考文献

附 录

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢