具有抑菌活性的桑树内生菌的分离鉴定及其抑菌物质研究

摘要

植物内生菌是一个多样性丰富而复杂的微生物类群。研究发现,植物中内生菌可产生抗肿瘤、抑菌和杀虫等生物活性物质,是开发新天然药物的潜在来源。
　　本文中,以大肠杆菌为指示菌,从鲁桑桑枝组织中分离具有抑菌活性的内生菌,并通过形态学、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析对其进行鉴定;在单因素的基础上,利用响应曲面分析法对该菌株的发酵条件进行优化;通过乙酸乙酯萃取和硅胶层析等方法分离纯化该菌株发酵产物中的抑菌物质,并利用气相-质谱分析仪对抑菌物质的进行结构分析;通过紫外光谱、红外光谱和透射电镜等方法对该菌株的抑菌机理进行初步研究。取得以下研究结果:
　　从鲁桑桑枝组织中分离得到75株内生菌,其中,内生真菌49株,内生细菌26株;筛选出2株具有抑菌活性的内生菌ME1和ME2。形态学和生理生化特征表明:菌株 ME1是具有鞭毛和芽孢,无荚膜的革兰氏阳性菌,细胞呈杆状,大小0.6～0.7μm×1.8～1.9μm;能够利用葡萄糖、蔗糖、乳糖和淀粉,不能利用酪蛋白;菌株ME2是具有鞭毛和芽孢,无荚膜的革兰氏阳性菌,细胞呈杆状,大小0.6～0.7μm×1.5～1.6μm;能够利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉和酪蛋白。依据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》,初步鉴定菌株ME1和ME2为芽孢杆菌。通过16S rRNA基因序列分析,最终鉴定菌株 ME1(GenBank登录号:JQ900635)和ME2(GenBank登录号:JQ900623)为Bacillus subtilis。
　　本文中,响应曲面分析法优化出菌株 ME1的最优培养基组成为:马铃薯浸提物6.04 g/L、葡萄糖30.80 g/L、硝酸铵10.20 g/L、氯化钙19.80 g/L;最优发酵参数为:接种量2％,装液量50％,培养基初始pH7.08,发酵时间72 h,发酵温度27.9℃,转速152 r/min。在此条件下,ME1菌株发酵产物对大肠杆菌的抑制圈直径为24.27 mm。
　　气相-质谱分析结果表明:菌株ME1发酵产物中主要存在(2,5-二甲基-1-对氯苯基-3-亚甲基)-N-(5-异喹啉基)胺、3,6-二丁基-1,2-二氢-1,2,4,5-四嗪、4,4a,5,6,7,8,9,9a-八氢-10,10-1,4-甲醇-1H-环庚烷[d]哒嗪、壬二酸-二(2-甲基丙基)酯和2,4-二[P–氯苯乙烯基]-5-硝基噻唑等具有抑菌活性的化合物。
　　菌株ME1的发酵液粗提物(Extr.01)能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在对数期中的生长;通过对指示菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)培养液进行紫外光谱和红外光谱分析发现,ME1的发酵液粗提物(Extr.01)能够促使指示菌细胞内溶物外泄。透射电子显微镜观察表明ME1的发酵液粗提物(Extr.01)能够破坏指示菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)细胞壁和细胞膜结构,使其细胞膜和细胞壁通透性增强,引起细胞内容物外泄,最终导致细胞死亡。

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Contents

第1章 绪 论

1.1 前 言

1.2 内生菌的概述

1.3 代谢产物活性

1.4 桑树内生菌研究现状

1.5本文研究的目的、意义与主要内容

1.6本研究的主要技术路线

第2章 桑树抑菌内生菌的分离和筛选

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

第3章 桑树抑菌内生菌ME1和ME2的鉴定

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

第4章 菌株ME1发酵条件的优化

4.1试验材料

4.2 试验方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

第5章 菌株ME1抑菌物质的分离纯化及其结构鉴定

5.1试验材料

5.2 试验方法

5.3 结果与分析

5.4 本章小结

第6章 菌株ME1抑菌机理的初探

6.1试验材料

6.2 试验方法

6.3 结果与分析

6.4 本章小结

结 论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢