家蚕微孢子虫β-tubulin原核表达及丙硫咪唑对其基因抑制的研究

摘要

微孢子虫(Microsporidia)是一类广泛存在的,极其古老的专性细胞内寄生的真核生物,能感染从无脊椎动物到人的几乎所有的动物,是许多昆虫、鱼类、皮毛动物、啮齿类动物的重要病原。由家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)寄生家蚕发生的微粒子病,对蚕业生产,尤其是蚕种生产造成严重的经济损失。
　　丙硫咪唑能够特异性地结合在微孢子虫的β-tubulin基因上,抑制β微管蛋白与α微管蛋白组装成微管或使已组装的微管解聚,使纺锥体不能形成,阻止细胞的有丝分裂。只要细胞DNA发生变化,细胞的有丝分裂受到影响,都可表现出微管蛋白的变化。为了验证丙硫咪唑对家蚕微孢子虫抑制作用的机制,本研究选用家蚕品种P50,采取接种N.bombycis为对照组、接种N.bombycis后再用丙硫咪唑添食处理为药物处理组,在7个不同时段(丙硫咪唑处理后6h、18h、42h、66h、90h、114h、138h)后分别取4种组织(中肠、丝腺、血液、脂肪体),提取总RNA,检测其质量和浓度,然后建立SYBR Green实时荧光定量PCR基因相对定量表达技术平台。内参基因β-actin和目的基因家蚕微孢子虫β-tubulin基因经PCR扩增之后均只有一条扩增条带。溶解曲线单峰,说明无基因组DNA污染,扩增效率在80％-120％之间,在中肠中随着时间增长,添食丙硫咪唑的家蚕微孢子虫β-tubulin基因表达量相对于只添食家蚕微孢子虫的逐渐减小,在138h达到最低为0.003。研究表明家蚕微孢子虫β-tubulin基因表达明显地受到丙硫咪唑的抑制,在脂肪体、血液和丝腺中也是整体呈现下降的趋势。
　　本研究通过构建家蚕微孢子虫β-tubulin重组原核表达载体,并将之转化大肠杆菌BL21诱导表达家蚕微孢子虫β-tubulin融合蛋白。酶切和测序结果显示原核表达载体构建成功。SDS-PAGE检测大部分蛋白存在于包涵体沉淀中,蛋白诱导表达的最佳条件为37℃,IPTG终浓度为0.2μM,诱导时间为6h,经过超声波破碎和蛋白纯化,Western blot检测表明蛋白纯化效果良好,为家蚕微孢子虫β-tubulin多克隆抗体的制备,也为今后验证不同处理方式下各种组织中家蚕微孢子虫β-tubulin蛋白表达差异奠定了基础。

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Contents

第1章 绪论

1.1 家蚕微孢子虫微管蛋白研究背景

1.2 微管蛋白的研究进展

1.3 本文的研究方法

1.4 荧光定量PCR及原核表达的应用及发展

1.5 本文研究目的、意义

第2章 丙硫咪唑对家蚕微孢子虫β-tubulin基因表达抑制作用的研究

2.1 前言

2.2 实验材料与试剂

2.3 实验方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论

第3章 家蚕微孢子虫β-tubulin原核表达及蛋白纯化

3.1 前言

3.2 实验材料与试剂

3.3 实验方法

3.4 结果与分析

3.5 讨论

结 论

参考文献

附录1 家蚕微孢子虫β-tubulin部分序列（DQ663475.1）

攻读学位期间发表的学术论文

致谢