家蚕耐氟近等基因系敏感个体和耐氟个体差异表达基因分析及Asp基因的克隆

摘要

养蚕业是中国农业的重要组成部分,尤其是在西部地区,对增加农民收入起着重要作用,近几年桑蚕业的综合利用也得到了较大发展。但是由于我国乡镇工业的发展,蚕区的氟化物污染已严重威胁到养蚕业,已对我国的养蚕业造成了重大经济损失。家蚕的耐氟性状是一种重要的经济性状。遗传学试验表明,家蚕的耐氟性状是由多基因共同作用的。在家蚕品种T6中存在耐氟显性主效基因,如果能对该基因进行进一步研究,并克隆出来,将对培育耐氟家蚕品种及研究家蚕耐氟机理有重要意义。
　　之前我们构建了家蚕耐氟近等基因系SSH文库,但是由于方法的局限性,得到的数据不全面,假阳性高,不准确。
　　为了更准确、更全面地了解并筛选与家蚕耐氟相关的基因,本实验通过数字基因表达谱(Digital Gene Expression Profile)测序技术,对家蚕耐氟近等基因系群体中的敏感个体和耐氟个体进行了数字基因表达谱(DGE)测序。在耐氟个体和敏感个体中分别得到了3612399个和3567631个高质量测序标签(clean tags),对应的标签种数(distinct clean tags)分别为32933和43976。差异基因分析显示,以敏感个体为对照,有30个基因在耐氟个体中是上调的,211个基因是下调的,值得注意的是其中有5种不同的丝氨酸蛋白酶基因,且都是上调表达,猜测丝氨酸蛋白酶跟家蚕的耐氟性有关联。Pathway功能富集分析结果表明与核糖体合成、谷胱甘肽代谢、甘油脂代谢、类固醇的生物合成相关的基因,在敏感个体中的表达量均高于耐氟个体。其中与甘油代谢、类固醇的生物合成(Steroid biosynthesis)和谷胱甘肽代谢相关基因表达发生变化,这与以前的研究相吻合,推测这3个代谢过程与家蚕的耐氟性状有关。
　　同时我们克隆了一个在两种文库中都差异表达的基因的全长cDNA,将该基因命名为Asp(GenBank登录号:JX312360)。该基因cDNA全长868bp,包括20bp的5′-UTR和77bp的3′-UTR,ORF为771bp,编码256个氨基酸。该基因由4个外显子和3个内含子组成,编码的蛋白质为亲水性蛋白,属于丝氨酸蛋白酶家族,在第17～18氨基酸残基处存在信号肽切割位点。荧光定量PCR检测该基因在家蚕耐氟近等基因系群体幼虫的中肠、脂肪体及马氏管中都有表达,表达量因耐氟性而存在差异:中肠中,敏感个体的表达量是耐氟个体的2.49倍;脂肪体中,敏感个体的表达量和耐氟个体的差异不显著(相差1.17倍);马氏管中,敏感个体的表达量是耐氟个体的8.16倍。研究结果提示,该碱性丝氨酸蛋白酶基因与家蚕的耐氟性能有一定的关联。

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第1章 绪论

1.1 理论意义与实用价值

1.2 氟化物中毒

1.3 家蚕耐氟的研究现状

1.4 数字基因表达谱（DGE）

1.5 本课题的研究背景和内容

第2章 家蚕耐氟个体和敏感个体的数字基因表达谱测序及差异基因的分析

2.1 实验材料与主要仪器

2.2 实验步骤

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第3章家蚕Asp基因的克隆及组织表达特征

3.1 主要材料与试剂

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

结 论

参考文献

附录1

附录2

附录3

附录4

攻读硕士学位期间发表过的论文

致谢