鳞翅目害虫桑蟥与小菜蛾孵化酶基因的克隆、表达与特性分析

摘要

桑蟥与小菜蛾都是鳞翅目害虫，桑蟥属于鳞翅目蚕蛾科桑蟥属，是桑园里的主要害虫之一，而小菜蛾属于鳞翅目菜蛾科，是一种世界性的重大农业害虫。本文以这两种害虫作为研究材料，利用RACE-PCR和SMART cDNA合成技术，获得了桑蟥、小菜蛾孵化酶基因（RmHE、PxHE）全长cDNA序列。
　　RmHE cDNA序列全长为1325bp，包含一段885bp的完整开放阅读框，编码294个氨基酸，其中N端16个氨基酸为信号肽序列，C端208个氨基酸为成熟酶蛋白序列。RmHE分子量为33.41kD，等电点为5.80。RmHE氨基酸序列第92至242之间是一个锌依赖的金属蛋白酶结构域。同源性分析显示RmHE与其它物种孵化酶蛋白功能区序列的相似性为83.8％至30.1%，其中桑蟥与野蚕的同源性最高。PxHE cDNA序列全长为938bp，该基因序列包含一个882 bp的完整ORF，编码293个氨基酸残基，N端有16个氨基酸的信号肽，成熟酶区由208个氨基酸组成。PxHE蛋白分子量为33.23kD，等电点为4.99。PxHE氨基酸序列第91至241之间是一个锌依赖的金属蛋白酶结构域。PxHE与其它物种孵化酶蛋白功能区序列的同源性为79.2%—29.1%，其中小菜蛾与蓖麻蚕的同源性最高。生物信息学分析表明RmHE与PxHE具有孵化酶的两个特征序列HExxHILGFLHMQSTYNR和YDYVSCLHY。SWISS-MODEL软件预测的两者三维结构与斑马鱼孵化酶的高度吻合。
　　桑蟥孵化酶转录本随胚胎发育进程而变化，在孵化时候达到最高，表明其在胚胎发育和孵化行为中可能扮演重要作用。另外其转录本存在于幼虫中肠组织，以提取的幼虫各组织总蛋白为材料，Western blot检测发现RmHE以成熟酶形式存在于中肠组织，表明RmHE可能具有消化食物的功能。小菜蛾孵化酶基因为单外显子基因结构，不同于家蚕孵化酶基因的多外显子基因结构，并预测到该基因5'上游-52至-3区域为核心启动子序列区。此区域不仅包括一些基本的启动子元件，如TATA-盒和GC-盒，还包含一些与胚胎发育密切相关的转录因子结合位点，如HSF1和GATA-1。同源性分析发现在虾红素蛋白酶家族中具有保守的四个半胱氨酸残基，构建的进化树中蚕蛾科、大蚕蛾科以及菜蛾科处于不同聚类群。
　　另外，将RmHE和PxHE的ORF序列、去信号肽序列、成熟酶序列对应的基因序列克隆到原核表达系统中进行蛋白表达，Western Blot验证其获得高效表达。所获的实验结果为进一步阐明桑蟥和小菜蛾孵化分子机理奠定了基础，为开发以孵化为靶点的杀虫剂的研发提供了基础信息。

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第1章 绪 论

1. 1 本课题的研究目的与意义

1. 2 动物孵化分子机理研究进展

1. 3 本文主要研究内容

第2章 桑蟥孵化酶基因（RmHE）的克隆与特性分析

2. 1 实验材料与方法

2. 2 实验结果与分析

2. 3 讨论

2. 4 本章小结

第3章 RmHE的原核表达与功能验证

3. 1 材料与方法

3. 2 实验结果与分析

3. 3 讨论

3. 4 本章小结

第4章 小菜蛾孵化酶基因（PxHE）的克隆与特性分析

4. 1 实验材料与方法

4. 2 实验结果与分析

4. 3 讨论

4. 4 本章小结

结论

参考文献

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