桑蟥卵孵化酶基因的克隆与原核表达

摘要

桑蟥是桑园里的主要害虫之一,属于鳞翅目蚕蛾科桑蟥属.本文根据鳞翅目昆虫已鉴定的孵化酶基因保守序列合成兼并性引物,并从桑蟥转青卵中克隆出部分孵化酶基因.通过RACE-PCR和SMART cDNA合成技术,获得了桑蟥孵化酶基因(RmHE)全长序列.RmHE长1355bp,其中包含906bp的开放阅读框,编码301个氨基酸,其中有23个氨基酸残基为信号肽序列,208个氨基酸为成熟蛋白酶.同源性分析显示RmHE与BmandHE,BmHEL,ApHEL,BmHELII,CuefHCE,DmHEHS,XHE,MLCE,MHCE23,EHE12,ZHCE1,TuHE,QHE和Astacin蛋白酶功能区序列的相似性分别是83.8％, 82.4％, 80.4％, 74.0％, 44.6％, 42.0％, 33.5％, 32.8％, 32.6％, 32.3％, 32.3％, 32.1％, 31.6％ and30.1％.孵化酶相似的两个特征序列HEWMHILGFLHMQSTYNR和YDYVSCLHY存在于RmHE中,另外还发现了在虾红素蛋白酶家族中保守的四个半胱氨酸残基.根据进化树分析显示桑蟥与野蚕的亲缘关系最近.在卵孵育期不同发育阶段中,RmHE转录本在早期可被检测到并维持较低水平,从孵育的第8天开始剧增并在第9天达到最高值.RmHE转录本随胚胎发育过程和孵化而变化,表明其在孵化过程中起重要作用.另外,RmHE转录本可在幼虫的中肠中检测到,推测RmHE可能还有食物消化等其它生物学功能.将RmHE去信号肽对应核苷酸序列、成熟酶功能区对应核苷酸序列分别克隆入原核表达载体pET28a,在大肠杆菌BL21中获得高效表达.本文是首次对害虫卵孵化分子机理进行探索研究,预期结果将为以孵化酶为靶点的新型杀虫剂研发提供基础信息.