癌症患者CD4CD25Treg细胞比例变化以及hGITRL蛋白表达和单克隆抗体制备

摘要

目的：探讨癌症患者外周血中CD4+CD25+调节性T(regulatoryT，Treg)细胞的变化及其机制；体外表达hGITRL并制备特异性单克隆抗体，为进一步研究GITRL-GITR(glucocorticoid-induced TNFreceptor)信号转导途径干预Treg细胞的免疫抑制功能奠定基础。
　　 方法：(1)通过流式细胞仪(flow cytometry，FCM)技术检测癌症患者外周血CD4+CD25+T细胞及CD8+T细胞、CD16+CD56+NK细胞亚群比例。(2)利用癌症患者恶性胸水（5例）体外培养CD4+CD25-T细胞，并通过RT-PCR检测被诱导细胞的FOXP3基因表达，FCM动态检测CD4+CD25+FOXP3+T细胞比例，淋巴细胞增殖试验和抑制试验鉴定诱导性CD4+CD25+T细胞的生物学功能。(3)采用RT-PCR方法，从人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中获得hGITRL(human hGITRL)基因，并克隆至pMD-18T载体.选择阳性克隆进行酶切鉴定和序列测定。(4)从全长质粒hGITRL-pMD-18T中扩增hGITRL胞外段(hGITRL(aa52～177))，克隆至表达载体pQE30;将阳性重组质粒转化至大肠杆菌M15，IPTG诱导蛋白表达；表达蛋白用Ni2+-IMAC柱纯化、复性并通过Western blot进行鉴定，FCM检测hGITRL(aa52～177）重组蛋白与活化淋巴细胞上GITR的结合能力，淋巴细胞增殖试验分析其生物学活性。(5)重组hGITRL(aa52～177)免疫Balb/c小鼠，通过细胞融合和克隆技术，筛选分泌获得抗GITRL抗体的杂交瘤细胞株，并通过ELISA、Western blot和FCM对单克隆抗体进行鉴定。
　　 结果：(1)与健康对照组(n=30，4.7±1.2％)相比，癌症患者治疗前(n=56，12.4±5.6％)与治疗后(n=72，11.2±5.2％)CD4+CD25+T细胞比例均明显升高，但治疗前与治疗后组间无明显差异；鳞癌(n=33，11.4±5.6％)与腺癌(n=45，12.5±5.8％)患者CD4+CD25+T细胞比例无明显差别。(2)在恶性胸水诱导下，FCM显示有12.5±3.4％的CD4+CD25-T细胞可转化为CD4+CD25+FOXP3+T细胞，RT-PCR证实这些被诱导的CD4+CD25-T细胞有FOXP3基因mRNA表达。诱导性CD4+CD25+T细胞在抗CD3mAb(1μg/ml)和IL-2(50U/ml)的刺激下不发生增殖，并能抑制CD4+CD25-T细胞的增殖和IFN-γ的分泌。(3)成功克隆hGITRL基因，其编码区为534bp，编码177个氨基酸残基，与GenBank中公布的序列完全一致。(4)成功构建了hGITRL(aa52～177)-pQE30原核表达载体，表达相对分子质量约15KD的重组蛋白。该蛋白能与活化淋巴细胞膜上受体GITR结合，低浓度时能促进淋巴细胞的增殖，而在高浓度时则抑制了淋巴细胞的增殖。(5)获得两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株（Dd9和Dh8）。两株单克隆抗体识别不同的抗原表位，其腹水效价分别为1：1.5×106(Dd9)和1：2×106(Dh8)。Western blot及FCM显示这两株抗体分别能与重组hGITRL和HUVEC膜上GITR发生结合。
　　 结论：(1)癌症患者外周血CD4+CD25+T细胞比例明显增多，恶性胸水具有诱导分化CD4+CD25-T细胞表达FOXP3基因的能力，提示癌症患者CD4+CD25+Treg细胞比例增多源于肿瘤因素。(2)获得hGITRL基因质粒并成功表达了具有生物学活性的hGITRL(aa52～177)重组蛋白，GITR-GITRL相互作用对调节淋巴细胞的增殖具有重要作用。(3)成功制备了抗hGITRL单克隆抗体，为进一步研究hGITRL在免疫应答中的作用及与疾病的关系奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 CD4-CD25- Treg细胞与癌症的关系

1.1.1 CD4-CD25- Treg细胞简介

1.1.2 Treg细胞与癌症的关系

1.1.3 癌症患者体内CD4 CD25- Treg细胞增高的机制

1.1.4 CD4-CD25- Treg细胞抑制肿瘤免疫的机制

1.2 GITRL-GITR信号传导途径简介

1.2.1 GITRL及GITR简介

1.2.2 GITRL-GITR信号传导途径的生物学意义

1.3 本论文研究的目的、方法、实验方案的设计、意义

第二章 癌症患者外周血CD4+CD25+ Treg细胞的检测及临床意义

2.1 材料和方法

2.2 结果

2.2.1 癌症患者与健康对照组外周血CD4-CD25-T细胞比例的比较

2.2.2 外周血CD4-CD25-T细胞在多种癌症中的分布

2.2.3 CD4-CD25-T细胞与癌组织类型的关系

2.2.4 CD4-CD25-T细胞与其它淋巴细胞亚群的关系

2.3 讨论

第三章 恶性胸水体外诱导CD4+CD25+ FOXP3+ Treg细胞的研究

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.2.1 CD4-CD25-T细胞诱导分化成CD4-CD25-FOXP3- T细胞

3.2.2 诱导性CD4-CD25-FOXP3-T细胞的功能鉴定

3.3 讨论

第四章 hGITRL基因的克隆、原核表达及生物学功能研究

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.2.1 hGITRL基因RT-PCR扩增结果

4.2.2 hGITRL重组质粒的筛选与鉴定

4.2.3 hGITRL基因全长克隆测序结果及分析

4.2.4 原核表达载体hGITRL(aa52～177)-pQE30的构建及鉴定

4.2.5 hGITRL(aa52～177)×6His融合赁白的诱导表达及Western blot鉴定

4.2.6 hGITRL(aa52～177)重组蛋白与受体结合活性测定

4.2.7 hGlTRL(aa52～177)重组蛋白对PBMCs的作用

4.3 讨论

第五章 hGITRL单克隆抗体的制备及鉴定

5.1 材料和方法

5.2 结果

5.2.1 杂交瘤细胞系的建立

5.2.2 杂交瘤细胞染色体分析

5.2.3 单克降抗体的特性鉴定

5.3 讨论

第六章 主要结论与展望

6.1 主要结论

6.2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期问发表的文章

附录 中英文对照